La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.
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Articolo metodologico
Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)
In questo articolo
Sommario
Abstract
(ChIP-seq) metodi di ChIP-sequencing offrono direttamente la copertura dell'intero genoma, in cui combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il sequenziamento massivamente parallelo può essere utilizzato per identificare il repertorio di sequenze di DNA di mammifero vincolati da fattori di trascrizione in vivo. "Next-generation" tecnologie di sequenziamento del genoma forniscono 1-2 ordini di grandezza della quantità di sequenza che può essere costo-efficace generato più vecchie tecnologie consentendo metodi di ChIP-Seq per fornire direttamente la copertura dell'intero genoma per un efficace profiling dei mammiferi interazioni proteina-DNA.
Per successo approcci ChIP-Seq, si deve generare DNA stampo circuito integrato di alta qualità per ottenere i migliori risultati di sequenziamento. La descrizione è basata attorno esperienza con il prodotto proteico del gene più fortemente implicato nella patogenesi del diabete di tipo 2, cioè il fattore di trascrizione fattore di trascrizione 7-like 2 (TCF7L2). Questo fattore è stato anche implicato in vari tumori.
Delineato è come generare modello di DNA circuito integrato di alta qualità derivato dalla linea cellulare di carcinoma del colon-retto, HCT116, al fine di costruire una mappa ad alta risoluzione attraverso il sequenziamento di determinare i geni legati da TCF7L2, dando una visione più completa per il suo ruolo chiave nella patogenesi di tratti complessi.
Introduzione
Per molti anni c'è stato un bisogno insoddisfatto per identificare l'insieme di geni legati e regolata da una proteina determinato genoma, in particolare quelli della classe fattore di trascrizione.
Odom et al. 1 usato immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in combinazione con microarrays promotore per identificare sistematicamente i geni occupati dai regolatori trascrizionali pre-specificati, in fegato umano e di isole pancreatiche. Successivamente, Johnson et al. 2 sviluppato un saggio di immunoprecipitazione della cromatina larga scala basata sul sequenziamento del DNA ultra high thr....
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Protocollo
1. Cross-Link cromatina
- Crescere le cellule in piatti di coltura di cellule 100x20mm. La quantità di celle può variare da 1 a 10 milioni di cellule per piastra seconda del tipo cellulare. Circa 2 milioni di cellule è sufficiente per una immunoprecipitazione.
- Cellule del legame incrociato a 1% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente con dondolo occasionale.
- Quench reticolazione aggiungendo una concentrazione finale di 125 mM glicina e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con fosfato 1X Soluzione salina tamponata (PBS) due volte, decantare PBS e aggiungere 0,2 ml di PBS.
- Celle di rac....
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Risultati
Una volta che la cromatina è stato sonicato e sono stati trattati con RNasi e proteinasi, i campioni eseguiti sul gel di agarosio 2% dovrebbero presentare uno striscio con il grosso del DNA alla dimensione voluta. Se più cicli differenti vengono testati, una graduale diminuzione della dimensione dovrebbe essere visto come il numero di cicli di aumento (Figura 2).
Dopo aver completato la porzione immunoprecipitazione del protocollo di arricchimento può sia essere controllato .......
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Discussione
E 'ora possibile effettuare un genoma profilo di proteina-DNA associazione interazioni utilizzando ChIP-Seq, come è stato di recente dimostrato con altri fattori di trascrizione 2,3. La chiave per un esito sequenziamento di successo è la generazione di un modello di alta qualità cromatina immunoprecipitazione DNA.
Una volta che il DNA templato è stato generato e accertato essere opportunamente arricchito, si può poi prendere in preparazione per la successiva raccolta sequenzia.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Il lavoro è supportato da un Premio Istituto per lo sviluppo da Ospedale Pediatrico di Filadelfia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di purificazione PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | |
| Kit EZ-ChIP | Millipore | 17-371 | |
| GoTaq Hot Start Polimerasi | Promega | M5001 | |
| Sonicatore Misonix Spettrofotometro | Qsonica | XL-2000 | |
| NanoDrop 1000 | Thermo-Scientific | ||
| Sequenze di primer di controllo positivo (TCF7L2-1) Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' Sequenze di primer di controllo negative (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGTGTGTGTGTGTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3' |
Riferimenti
- Odom, D. T., et al. Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors. Science. 303, 1378-1381 (2004).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316, 1497-1....
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Ristampe e permessi
