Dimostriamo come eseguire macrofagi RM con mezzo di contrasto ultrasmall superparamagnetico (USPIO) in artrite settica, consentendo un iniziale e longitudinale In vivo Valutazione non invasiva di macrofagi infiltrazione e una valutazione della efficacia terapeutica.
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Articolo metodologico
In vivo Macrofago Imaging Utilizzando MR mirata di contrasto agente per la valutazione longitudinale di artrite settica
In questo articolo
Sommario
Abstract
I macrofagi sono cellule-chiave nella iniziazione, lo sviluppo e la regolazione della risposta infiammatoria alle infezioni batteriche. I macrofagi sono intensamente e sempre reclutati nelle articolazioni settiche dalle prime fasi di infezione e l'infiltrazione si suppone a regredire una volta efficace rimozione dei patogeni è ottenuto. La capacità di identificare in vivo l'attività dei macrofagi in un giunto infetto può quindi fornire due applicazioni principali: rilevamento precoce di sinovite acuta e monitoraggio della terapia.
In vivo rilevamento non invasivo di macrofagi può essere eseguita con la risonanza magnetica utilizzando nanoparticelle di ferro come ultrasmall superparamagnetico ossido di ferro (USPIO). Dopo somministrazione endovenosa o intra-articolare, USPIO sono specificamente fagocitate dai macrofagi attivati e, a causa delle loro proprietà magnetiche, provocare variazioni del segnale in tessuti che presentano infiltrazione dei macrofagi. Un quantitativvalutazione e della infiltrarsi è fattibile, come la zona con perdita di segnale (numero di pixel scuri) osservata il gradiente echo immagini MR dopo iniezione di particelle è correlata con la quantità di ferro all'interno del tessuto e quindi riflette il numero di cellule USPIO-caricati.
Presentiamo qui un protocollo per eseguire l'imaging macrofagi utilizzando USPIO-enhanced RM in un modello animale di artrite settica, consentendo un iniziale e longitudinale nella valutazione non invasiva in vivo di macrofagi infiltrazione e una valutazione delle iniziative terapia.
Introduzione
La risonanza magnetica (MRI) è considerato essere la modalità di imaging di scelta per la dimostrazione di sinovite infettiva dovuta alla sua elevata risoluzione spaziale e di contrasto dei tessuti molli. Cambiamenti del segnale osservati alla risonanza magnetica in artrite bassa T1 e T2 alta segnale che riflette la maggiore presenza di contenuto di acqua extracellulare, e un marcato enhancement dopo gadolinio basato contrasto amministrazione agente, coerenti con le istologicamente risultati di vascolarizzazione aumentata grazie alla vasodilatazione e l'angiogenesi 1. Tuttavia, la RM è spesso in grado di dimostrare la risoluzione di infezione durante la terapia antibiotica come potenziamento persistente può essere osservato nelle articolazioni dei pazienti con clinicamente e biologicamente guarito artrite settica dovuta alla persistenza delle allargata spazio extracellulare (tessuto di granulazione, cicatrice fibrotica) 2. Oltre ai cambiamenti extracellulari, cellule infiammatorie, tra cui un intenso reclutamento di macrofagi massicciamente infiltrano l'ininfetti sinovia. I macrofagi giocano un ruolo importante sia nella fase acuta e cronica di infezione batterica 3. Inducono la reazione infiammatoria necessaria per sradicare microrganismi patogeni, e coordinare risoluzione infiammazione, come macrofagi indotta infiammazione persiste fintanto tessuti necrotici non vengono rimossi, impedendo riparazione per iniziare 4. Così, la riduzione di infiltrazione di macrofagi all'interno infetto synovia dopo terapia efficace può essere un indicatore affidabile della risoluzione dell'infezione. Cellular imaging è in grado di dimostrare infiltrazione cellulare specifica all'interno tessuto patologico. Macrofagi specifico RM utilizzando mirati di contrasto è stato ampiamente indagato e ha dimostrato la sua capacità di dimostrare l'infiammazione delle articolazioni o infezione 5-7. Dopo iniezione endovenosa, questi agenti di contrasto mirati come USPIO particelle (ultrasmall ossidi di ferro superparamagnetiche) sono ripreso da fagociti come i macrofagi e,a causa delle loro proprietà magnetiche, indurre cambiamenti del segnale in tessuti che presentano infiltrazione di macrofagi 8. Il follow-up longitudinale di coloro segnale MR modifiche terapia consente una valutazione non invasiva in vivo di infiltrazione di macrofagi, e una riduzione della USPIO caricato-macrofagi relative variazioni di segnale dimostrerebbe successo terapia. Lo scopo di questa relazione è quello di presentare le modalità di esecuzione dei macrofagi RM per monitorare in maniera non invasiva artrite settica, dimostrando la riduzione di infiltrazione di macrofagi all'interno della sinovia.
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Hospital Animal Care University.
1. L'inoculazione batterica Strappo
- Prima dell'iniezione, anestetizzare conigli mediante iniezione intramuscolare di ketamina (30 mg / kg di peso corporeo) mescolato con xilazina (4 mg / kg) entro erettori spinali muscolare. Garantire gli animali sono completamente anestetizzato controllando che non riescono a rispondere a zampa pizzico. Questo protocollo prevede anestesia sufficiente per l'iniezione intra-articolare del ginocchio. Posizionare gli animali sotto la maschera di ossigeno durante l'anestesia.
- Shave ginocchio animali. Preparare il ginocchio per iniezione asettiche da 3 alternati salviette di povidone-iodio macchia e alcol seguita dalla applicazione della soluzione di iodio povidone.
- Identificare manualmente il tendine rotuleo come una struttura elastica alla faccia anteriore del ginocchio usando un tappo ago sterile come illustrato oppure una sonda sterile.
- Con il controllo visivo e utilizzando un approccio anteriore, inserire un ago G 25 percutanea al ginocchio destro di ciascuno dei 12 conigli attraverso il tendine rotuleo.
- Iniettare ciascun ginocchio con 1 ml di una sospensione batterica di Staphylococcus aureus (ceppo Neumann) ad una concentrazione di 10 6 UFC / ml. Una iniezione senza resistenza conferma la posizione intrarticolare della punta dell'ago.
- Dopo procedure di iniezione, tenere l'animale sotto fonte convettivo per evitare dispersioni di calore e monitorare la frequenza respiratoria osservando movimento del torace. Una volta sveglio, tenere gli animali in gabbie con libero accesso a cibo e acqua.
- Gestire il dolore con la somministrazione di un'iniezione intramuscolare di 0,1 mg / kg di buprenorfina ogni 8 ore.
- Clinicamente osservare conigli ogni giorno, il monitoraggio quantità consumate di cibo e acqua, perdita di peso, la temperatura, e il comportamento generale.
- Per l'immagine della fase acuta dell'infezione eseguire prima sessione di imaging MR appenacome animale presenta notevole perdita di peso (10%); generalmente questo avviene dopo circa 2 giorni.
- Se è necessaria la somministrazione del farmaco per via endovenosa prima di un esame MRI, un accesso venoso auricolare può essere installato (cfr. di seguito).
2. Esame MRI
Quando l'imaging di animali vivi, di un'installazione animale attento è una caratteristica fondamentale per garantire il comfort degli animali e l'anestesia ottimale. Questo permetterà di ottenere i migliori risultati di imaging e di garantire una acquisizione di immagini riproduttiva per studi longitudinali. A causa della dimensione dell'animale, l'uso di una unità MR clinico di dimensioni (1,5 T o T 3) è più adatto. Bobina ginocchio clinico 8-canale viene utilizzato in quanto fornisce adatto risoluzione e rapporto di contrasto-rumore per coniglio esplorazione ginocchio.
- Prima dell'installazione del sistema di imaging, installare un accesso venoso periferico attraverso una vena auricolare. Questo accesso servirà per iniettare il mezzo di contrasto.
- Shave e disinfettare l'orecchio.
- eseguire l'anestesia locale per iniezione sottocutanea di lidocaina.
- Inserire un catetere G 25 dentro l'auricolare vena laterale.
- Valutare la permeabilità mediante iniezione di 1 ml di soluzione fisiologica sterile.
- Mantenere il catetere con intercettazioni adesivo.
- Anestetizzare animali tramite iniezione intramuscolare di ketamina (30 mg / kg di peso corporeo) mescolato con xilazina (4 mg / kg). Gli animali sono completamente anestetizzato una volta non riescono a rispondere a zampa pizzico. Posizionare una maschera facciale sul coniglio, dandogli ossigeno con una portata di 200 ml / min.
- Una volta completamente anestetizzato, prendere gli animali per l'unità imaging MR. Posto animali così che le ginocchia sono situati nel centro della bobina MR. Posizionare le zampe dell'animale in estensione completa, in modo che l'asse lungo della tibia sia parallelo al tavolo unità di imaging MR. Utilizzare velcro o sacchetti di sabbia per mantenere la posizione ottimale delle gambe.
- Monitoraggio cardio-respiratorio degli animali non è richiesta laprotocollo di anestesia permette anestesia profonda respirazione spontanea, ma gli animali devono essere coperti per evitare dispersioni di calore anestesia indotta.
- Protocollo MR è dettagliato in Tabella 1. Il tempo medio per l'acquisizione totale compreso installazione ottimale è di circa 20 min.
- Eseguire la RM in piani diversi. Nondimeno, il piano trasversale delle ginocchia (ortogonale alla tibia) è il piano di riferimento in quanto garantisce la riproducibilità anatomica della posizione dell'immagine per esami longitudinali sequenziali e permette correlazione ottimale con fette istologiche.
- Al completamento di sequenze non potenziate, iniettare l'agente di contrasto UPSIO attraverso l'accesso venoso auricolare. Somministrare lentamente le particelle di ossido di ferro in una singola dose di 150 micromol Fe / kg. Risciacquare il catetere mediante iniezione di 1 ml di soluzione fisiologica sterile.
- Ripetere la sequenza rafforzata GRE pesata 24 ore dopo l'iniezione. Questo ritardo consente alle particelle di essere fagocitati dai macrofagi.
- Per gli studi longitudinali che valutano effetto farmaci (antibiotici, steroidi, anticorpi anti-macrofagi, ecc.), Ripetere esami RM sequenziali utilizzando il protocollo sopra descritto.
3. Image Analysis
- Per la valutazione longitudinale eseguire misure allo stesso livello anatomico, e di definire un punto di riferimento facilmente identificabile. Per esempio, attraverso l'acquisizione piano assiale in cui si osserva il maggior diametro della rotula è un modo affidabile per ottenere la misurazione riproducibile (Figura 1).
- Eseguire l'analisi delle immagini utilizzando un software DICOM-based (come OsiriX) o un software di elaborazione delle immagini (ImageJ).
- Utilizzando il software ImageJ, eseguire la segmentazione del territorio sinoviale che dimostra perdita di segnale sulle USPIO-enhanced GRE immagine pesata in T2 con la "zona irregolare" strumento di disegno. Una volta che la membrana sinoviale con segnale scuro è delineato, fai clic su "Analizza" per ottenere l'area /numero di pixel (figura 2).
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Risultati
Sulle immagini non potenziate, sinovia delle ginocchia infetti presenta un gonfiore diffuso segnale intermedio che è non distinguibile dal tessuto circostante molli, mentre femore e rotula appaiono come strutture basse segnale (Figura 1).
Sulle immagini USPIO avanzata, 24 ore dopo la somministrazione di contrasto, zona sinoviale contenente macrofagi USPIO-caricati dimostrerà perdita di segnale (figure 1 e 2).
Inf...
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Discussione
Mentre i mezzi di contrasto a base di gadolinio non specifici forniscono informazioni sul volume e perfusione dello spazio extracellulare, macrofagi imaging USPIO-enhanced MR permette una localizzazione anatomica precisa e una valutazione qualitativa di infiltrazione dei macrofagi all'interno sinoviale infetto, senza la necessità di campionamento tessuto 9. Grazie alla loro alta sensibilità, USPIO può dimostrare anche sottile infiltrato cellulare presente nelle prime fasi di infezione. Sotto terapia antib...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo di cuore F. Bierry per l'assistenza nella produzione video e di editing.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente/materiale | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| P904 | Guerbet | Dose: 150 μ mol Fe/kg | |
| Ketamina (500 mg/ml ketamina) | Virbac | Dose: 30 mg/kg | |
| Rompun (20 mg/ml xilazina) | Dose assiale | : 4 mg/kg | |
| Buprenorfina | Vetoquinolo | Dose: 0,1 mg/kg/8 ore | |
| BD 22 G, 1 pollice | BD Biosciences | 381423 | |
| BD 25 G, 5/8 pollice | BD Biosciences | 305122 |
Riferimenti
- Madri, J. Inflammation and healing. Anderson's Pathology. Kissane, J. , 67-110 (1990).
- Sephel, G., Woodward, S. Repair, regeneration, and fibrosis. Rubin's Pathology. Rubin, R., Strayer, D. , 5th ed, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. 71-98 (2008).
- Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of macrophages in Staphylococcus aureus-induced arthritis and sepsis. Arthritis Rheum. 43 (10), 2276-2282 (2000).
- Heale, J., Speert, D. Macrophages in bacterial infection. The Macrophage. Burke, B., Lewis, C. , Oxford University Press. Oxford, England. 210-252 (2008).
- Bierry, G., et al. Macrophage activity in infected areas of an experimental vertebral osteomyelitis model: USPIO-enhanced MR imaging--feasibility study. Radiology. 248 (1), 114-123 (2008).
- Bierry, G., et al. MRI of macrophages in infectious knee synovitis. AJR Am. J. Roentgenol. 194 (6), W521-W526 (2010).
- Lutz, A. M., et al. Detection of synovial macrophages in an experimental rabbit model of antigen-induced arthritis: ultrasmall superparamagnetic iron oxide-enhanced MR imaging. Radiology. 233 (1), 149-1457 (2004).
- Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175 (2), 494-498 (1990).
- Lefevre, S., et al. Septic arthritis: monitoring with USPIO-enhanced macrophage MR imaging. Radiology. 258 (3), 722-728 (2011).
- Sigovan, M., et al. Rapid-clearance iron nanoparticles for inflammation imaging of atherosclerotic plaque: initial experience in animal model. Radiology. 252 (2), 401-409 (2009).
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Ristampe e permessi
