L&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

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Articolo metodologico

L'analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

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DOI:

10.3791/50305

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18 marzo 2013

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

In questo articolo

Sommario

Qui si descrive una tecnica di microdissezione seguito da iniezione di colorante fluorescente nel ganglio acustico di embrioni di pollo primi selettiva per rintracciare uditive fibre assoni nel nervo e rombencefalo.

Abstract

Il pulcino embrionale è un modello ampiamente utilizzato per lo studio delle proiezioni gangliari periferiche e centrali cellulari. Nel sistema uditivo, etichettatura selettiva degli assoni uditivi all'interno del nervo cranico VIII aumenterebbe lo studio dello sviluppo del circuito uditivo centrale. Questo approccio è impegnativo, perché di vari organi sensoriali dell'orecchio interno contribuiscono al nervo VIII ^1. Inoltre, marcatori che distinguono affidabile uditivo rispetto vestibolari gruppi di assoni all'interno del nervo VIII aviaria devono ancora essere identificati. Vie uditive e vestibolari non si distinguono funzionalmente in embrioni precoci, come-sensoriali evocate risposte non sono presenti prima che i circuiti sono formati. Centrale sporgenti assoni dei nervi dell'VIII sono stati rintracciati in alcuni studi, ma uditivo etichettatura assone è stata accompagnata da etichettare dagli altri componenti del nervo dell'VIII ^2,3. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi anterograda dal ganglio acustico in modo selettivo labeassoni uditive l all'interno del nervo VIII in via di sviluppo. In primo luogo, dopo la dissezione parziale della regione anteriore cefalica di un 8 giorni di embrione di pollo immerso nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato, il condotto cocleare è identificato da punti di repere anatomici. Successivamente, una micropipetta di vetro sottile tirato è posizionata per iniettare una piccola quantità di rodamina destrano ammina nella regione di canale e adiacente profonda in cui si trovano le cellule gangliari acustici. Entro trenta minuti dopo l'iniezione, assoni uditive sono tracciate a livello centrale nel cervello posteriore e possono poi essere visualizzati a seguito della preparazione istologica. Questo metodo fornisce un utile strumento per gli studi di sviluppo della periferica alla formazione circuito centrale uditivo.

Protocollo

1. Preparare i seguenti strumenti di dissezione e reagenti

Fluido cerebrospinale artificiale (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM NaHCO _3, 3 mM di HEPES, 10 mM di glucosio, 2 mM CaCl _2, 1,3 mM MgSO ₄₎ continuo infuso con 95% O _2/5% di CO ₂ a temperatura ambiente. Per l'infusione, riempire per 2/3 da 500 ml a bocca larga vaso Nalgene con un foro nel coperchio. Serbatoio sarà collegato mediante la tubazione di un calice gorgogliatore, che penetra la aCSF attraverso il foro nel coperchio vaso. Regolare la pressione per ottenere un flusso costante di bolle che raggiungono circa 1/3 del liquido, ma non sono abbastanza forte da causare spruzzi sul bordo. Submerge 5 ml fiale di vetro (fino a 6) nel vaso Nalgene per separare campioni singoli da loro e dalla turbolenza del flusso di gas. ACSF dovrebbe essere ossigenato per almeno 20 minuti prima di qualsiasi incubazione tessuto.
Piccolo dissezione piatto in silicone (35 mm x 10mm rivestito Petri utilizzando Sylgard elastomero Kit) con due perni dissezione inseriti in piccolo polistirolo esagonale inferiore (47 mm) peso barca.
Due fine-tip pinza, una curva punta pinze, da 50 becher ml, e un contenitore per i rifiuti del tessuto.
Tirato micropipetta di vetro (1,2 OD / 0,9 ID) spezzato a circa 20-50 micron apertura in punta e riempito con rodamina destrano ammina (RDA, MW = 3000, Invitrogen) in una soluzione di 6,25% con 0,4% Triton X-100 in PBS . Collegare con un tubo in bene per picospritzer e stabilizzare a micromanipolatore.

2. Micro-dissezione per svelare Papilla basilare a E8 ^4,5

Con pinze curve, tagliare E8 embrione appena sotto il tronco cerebrale, mettendo la testa direttamente sulla siliconata piatto dissezione all'interno pesare barca.
Con perni dissezione, posizionare la testa con una vista ventrale così l'orecchio sul lato di interesse è leggermente visibile, la testa leggermente inclinata dorsalmente e puntando 10-30 gradi di distanza dal center (Figura 2A). Immediatamente fissare la testa con perni. Se bilaterale analisi è desiderato, il centro della testa a 0 gradi, o una visione completa ventrale in modo da entrambi i lati è possibile accedere. Analogamente, per un lato sinistro iniezione, bloccare la testa a -10 a -30 gradi dal centro in modo che il lato sinistro è accessibile.
Con i 50 becher ml, trasferire 30 ml di aCSF ossigenata nel piatto, sommergendo completamente il tessuto.
Afferrare con delicatezza e la buccia verso il basso la mascella inferiore con punta fine pinze, quindi rimuovere la palpebra inferiore sul lato di interesse.
Rimuovere il tessuto vascolare sovrastante, compresa qualsiasi palato rimanente e gola. Questi tessuti molli dovrebbero staccarsi rivelando la superficie liscia di sviluppare chondrocranium con le arterie vertebrali distintivi sulla sua superficie. Da questo punto, la caratteristica massa bianca otoconial dovrebbe essere visibile.
Sezionare con cura la pelle intorno al meato esterno, cartilagine della mandibola e l'orecchio medio, lasciando il diNER orecchio intatto. Utilizzare le pinze per tagliare delicatamente via queste strutture cartilaginee.
Rimuovere le arterie vertebrali e una pozza di sangue con un movimento gentile con le punte sottili pinze. Il sangue può oscurare vista e la coagulazione può collegare l'apertura pipetta di iniezione.
Il condotto cocleare con adiacente epitelio sensoriale (basilare papilla) e ganglio acustico si trova direttamente sotto la chondrocranium ⁶ e può essere visualizzato come una forma allungata oa forma di dita proiezione si estende dall'orecchio interno ventralmente, con la punta più distale (apice) in prossimità del anteriore linea mediana ^5. Ci può essere un raggruppamento di sangue (rosso) dalla dissezione e / o calcificazioni otolitici (bianco) all'apice del condotto cocleare (Figura 2B) che possono aiutare nella visualizzazione. Al vertice è la macula lagenar, una patch sensoriale pensato per essere della funzione vestibolare ^7,8.

3. Etichettatura selettiva di CN VIII Fibre uditiva

Posizionare la pipetta di iniezione vicino alla superficie dell'embrione nella regione cocleare papilla condotto e basilare.
Abbassare lentamente la micropipetta per forare prima il cranio. Questa regione cranica è più sottile di aree circostanti e richiede meno forza per penetrare. La micropipetta dovrebbe essere all'interno del canale cocleare. Opzionale: una piccola iniezione di tracciabilità colorante può essere fatto qui per aiutare a visualizzare la papilla basilare.
Senza il riposizionamento della micropipetta, continuare ad abbassare fino a quando incomincia viola il confine profondo del condotto cocleare (Figura 1). Effettuare un'iniezione qui e ripetere in più regioni lungo la lunghezza della papilla basilare (figure 2C, 2D), escludendo la punta più prossimale in cui si trova il lagena vestibolare. Con il picospritzer impostata tra 10-30 psi, diverse iniezioni sono fatte. Il volume del fluido iniettato colorante varia e dipende dal grado desiderato di etichettatura. Ogni iniezione dovrebbe portare a un colorante fluorescente-laposto Beled di circa 200-400 micron di diametro (Figura 2D).
Una volta che l'iniezione è terminata, usare il forcipe per transetto il campione al di sopra del tronco cerebrale e utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare la porzione caudale in un piccolo vaso all'interno del contenitore di aCSF continuamente perfuso con il 95% O _2/5% di CO _2.
Per ciascun embrione, 20-30 min per consentire il trasferimento di colore, a seconda della distanza del centro di traccia desiderata.
Rimuovere il tessuto e prepararsi per il sezionamento istologico. Nell'esempio qui illustrato, il tessuto viene immerso in paraformaldeide al 4% (in 1X PBS) overnight, saccarosio 30% (in 1X PBS) per una notte.

4. Di contrasto e analisi

Di contrasto è utile per contribuire a orientare l'osservatore a localizzazione anatomica, nonché identificare le regioni di particolare interesse. Un contrasto efficace in questa preparazione è immunomarcatura neurofilamenti (figure 1, 3B, 3E), cui L fortementeAbels assoni e permette di demarcazione di tratti assonali nel SNC.
Analisi deve essere eseguita in tutta la regione etichettata, come le sporgenze possono estendere diverse centinaia di micron o più lungo l'asse rostrocaudale. Alcuni esempi di analisi di base sono: tassi di errore di targeting, i tempi e / o modifiche divergenza di modelli di proiezione. Assoni RDA-etichettati sono visualizzati nel sistema nervoso centrale e periferico ad alta risoluzione (figure 3A, 3D).