Articolo metodologico

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

DOI:

10.3791/50310

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4 aprile 2013

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1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

In questo articolo

Sommario

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Un metodo per l'assemblaggio di gradienti adesivi e solubile in una camera per gli studi di microscopia vivi migrazione cellulare è descritto. L'ambiente di ingegneria combina superfici antivegetative e le tracce adesive con pendenze soluzione e permette quindi di determinare l'importanza relativa di spunti di orientamento.

Abstract

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Cellule possono percepire e migrare verso concentrazioni più elevate di stimoli adesive come le glicoproteine ​​della matrice extracellulare e spunti solubili come fattori di crescita. Qui, descriviamo un metodo per creare gradienti opposti di segnali adesivi e solubile in una camera microfluidica, che è compatibile con imaging cellulare vivo. Un copolimero di poli-L-lisina e polietilene glicole (PEG-PLL) è impiegato per passivare coprioggetto e prevenire adsorbimento non specifico di biomolecole e cellule. Successivamente, la stampa microcontatto o litografia dip penna sono utilizzati per creare percorsi di streptavidina sulle superfici passivati ​​per servire come punti di ancoraggio per il peptide biotinilato arginina-glicina-acido aspartico (RGD) come cue adesivo. Un dispositivo microfluidico è disposto sulla superficie modificata e utilizzata per creare il gradiente di segnali adesivi (100% allo 0% RGD RGD) sulle tracce streptavidina. Infine, lo stesso dispositivo microfluidico è usato per creare un gradiente di suc chemoattractanth come siero bovino fetale (FBS), come cue solubile in direzione opposta del gradiente di segnali adesivi.

Introduzione

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Migrazione cellulare Regia è una proprietà fondamentale di molte cellule ed è un aspetto fondamentale di molti processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la difesa contro le infezioni e guarigione della ferita. Inoltre, la migrazione cellulare gioca anche un ruolo importante in molte malattie quali malattia vascolare, cellule tumorali e metastasi 1,2 infiammazione cronica. Mentre gli stati classici della migrazione cellulare - polarizzazione, estensione protrusione, la formazione di adesione, la generazione di forza e retrazione posteriore - sono generalmente accettate 3,4, la delucidazione dei meccanismi spazio-temporali da cui esso è coordinato integrazione del segnale è stato più impegnativo.

La matrice extracellulare (ECM) serve come substrato per l'adesione cellulare, e attraverso chimica e fisica inerente 5 6 diversità, fornisce indicazioni direzionali per cella 7,8 navigazione. In aggiunta a questi segnali adesive 9, fattori solubili 10-12 </ Sup>, come chemochine e fattori di crescita in grado di indurre la migrazione delle cellule attraverso i recettori chemiotattico diretto e la loro segnalazione a valle motogenic. Attualmente, non è noto se l'impegno e segnalamento attraverso recettori di adesione integrine (cioè) o recettori chemoattraente, come recettore tirosina chinasi (RTK), sono dominanti. Non è neppure noto se gerarchie di sistemi recettoriali sono tipo specifico delle cellule.

Microscopia di cellule in diretta dà una ricchezza di informazioni che non è accessibile nei test di massa e può essere combinato con dispositivi microfluidici per generare gradienti immobilizzati di spunti 13,14 e solubile 15 16. Il metodo qui descritto utilizza una serie di semplici passaggi e consolidata per modificazione superficiale in combinazione con una camera disponibile in commercio microfluidica per creare un saggio di imaging per la migrazione cellulare che può essere facilmente implementato in un laboratorio di biologia cellulare (Figura 1). L'assemblatodispositivo a microfluidi ha qualità ottiche che sono paragonabili al vetro 17 e il gradiente di molecole diffusibili sono stabili per almeno 16 ore. Il sistema può essere utilizzato per tecniche epifluorescenza e avanzate. A differenza di altre configurazioni chemiotassi 18, questo sistema è adatto per la registrazione lenta migrazione, cellule aderenti. Importante, il sistema è modulare e permette facilmente l'introduzione di adesivo alternativa o segnali migrazione solubili e l'esame di vari tipi cellulari.

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Protocollo

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1. Passivazione di vetrini con PLL-PEG-biotina

Questa fase ha lo scopo di passivazione della superficie in modo che le cellule aderiscono e migrare su regioni specifiche sul vetrino di vetro che vengono creati con la stampa microcontract (Fase 2-3a) o litografia dip penna (Step 3b). Per la passivazione, un co-polimero di poli-L-lisina (PLL) e polietilene glicole (PEG) viene utilizzato in cui il 20% delle molecole di PEG sono stati innestati biotina (PLL-PEG-biotina).

  1. Per la pulizia coprioggetto di vetro (18 mm x 18 mm), immergere in un rack in 100% di etanolo e la cremagliera in un bagno sonicating per 30 minuti. Asciugare i vetrini in aria o in corrente di azoto.
  2. Successivamente, i vetrini sonicazione per 30 min in 1 M NaOH. Successivamente sciacquare le superfici in vetro con cautela immergendo il rack in un bicchiere pieno di 1.5 L Milli-Q H 2 O. Ripetere il processo di risciacquo tre volte utilizzando fresco Milli-Q H 2 O di volta in volta. Asciugare i vetrini inun forno a 60 ° C.
  3. Mezzo posto del vetro pulito coprioggetti singolarmente in una camera umida, che è fatto di una piastra a 24 pozzetti parzialmente riempito con H 2 O. Goccia 15 ml di PLL biotina-PEG-(1 mg / ml) in PBS su ciascun vetrino coprioggetto. Prendere l'altra metà dei restanti coprioggetto di vetro pulito e con attenzione a sandwich la soluzione PEG. Lasciare i vetrini per 1 ora nella camera umida. Far scorrere i coprioggetti sandwich delicatamente distanza l'uno dall'altro, senza raschiare il PEG superficie verniciata e sciacquarle con Milli-Q H 2 O. L'acqua deve scorrere via facilmente sul lato PEG-trattati. Se necessario, asciugare i vetrini su carta assorbente con la superficie trattata rivolta verso l'alto. Conservare i vetrini in un essiccatore sotto vuoto fino all'uso successivo.

2. Fabbricazione di francobolli per la stampa microcontatto

Descriviamo due processi alle tracce streptavidina modello sui vetrini passivati. Il primo, microfonorocontact stampa, tipicamente richiede la realizzazione di un master di silicio da cui viene colato un timbro PDMS. Nel nostro caso, il modello del timbro PDMS sono 100 um livello linee che sono distanziati 290 micron da centro a centro con un'altezza caratteristica di 25 micron. Qui di seguito, si descrive brevemente come fabbricare un maestro adatto al silicio (Step 2,1-2,3) e timbro PDMS (Fase 2.4). Tuttavia, ci sono più protocolli per la stampa microcontatto descritti in letteratura 19-23, che sono adatti per la stampa su modelli proteici coprioggetto. Master può anche essere fatta su misura e acquistati da fonti commerciali.

  1. Prima, pulire il wafer di silicio (4 "di diametro) incubando in soluzione Piranha (3:1 v: v di acido solforico e perossido di idrogeno al 30%). Per 20 min Sciacquare accuratamente il wafer 10 volte con MilliQ H 2 O. Essiccare il wafer in un forno a 150 ° CO / N.
  2. Risciacquare il wafer di silicio pulita ed essiccata con il 100% di acetone, seguito da 100% di alcol isopropilico. Prossimospin-coat 2 ml di GM1070 SU-8 photoresist (Gersteltec Sarl) sul wafer a 3.100 rpm per 40 secondi per creare un 25 spesso strato micron. Il campione viene quindi cotta su una piastra calda a 65 ° C per 5 minuti seguiti da un ulteriore 5 min a 95 ° C.
  3. Esporre il SU-8 fotosensibile ai raggi UV per 60 secondi sotto un fotomaschera con il modello desiderato (ad esempio utilizzando un Quintel Q6000 maschera allineatore) e ripetere il processo di cottura descritto al punto 2.2. Allora il campione è sviluppato immergendo il wafer in SU-8 developer (Gersteltec Sarl) per 4 min, sciacquati in 100% alcool isopropilico ed essiccato sotto flusso di azoto. L'area del SU-8 photoresist che non è stato esposto a luce UV viene quindi rimosso, creando il pattern inverso del timbro PDMS.
  4. Il passo successivo è quello di lanciare un timbro PDMS dal master silicio. Primo, mescolare 1 parte (w / w) del catalizzatore con 10 parti di prepolimero elastomero (Sylgard 184). Per eliminare eventuali bolle d'aria, la miscela degas in un essiccatore collegato a una linea di vuotoper 1 ora. Successivamente, versare l'elastomero PDMS sul master silicio all'interno una capsula di Petri a circa 1 cm di altezza e curare la miscela master e PDMS in un forno a 70 ° C per 1 ora. Infine, il timbro PDMS viene rimosso dal master silicio e tagliato a misura.

3. Patterning streptavidina o Cue adesivi sul coprioggetto di vetro passivato

Dopo passivante vetrini, profili proteici sono stampate con stampa microcontact (3a Fase) o dip-pen litografia (Step 3b). Nel nostro caso, streptavidina viene stampato come linee, che costituiscono la base per gradienti RGD (Passaggio 4). La stessa procedura può essere utilizzata anche per la stampa di proteine ​​di matrice per creare modelli adesivi.

Un metodo alternativo per la stampa microcontatto per il patterning di biomolecole su superfici è litografia dip penna. In litografia dip penna, un cantilever viene utilizzato per trasferire un piccolo volume di soluzione sulla superficie. Le dimensioni dei cantilever, viscosità della soluzione, il tempo di contatto del cantilever sulla superficie, idrofobicità della superficie e l'umidità nella camera di stampa determina la dimensione delle caratteristiche stampati. Il vantaggio di questo metodo è che diversi modelli possono essere stampati per ogni esperimento, in quanto non vi è alcuna necessità di fabbricare maestri e timbri. Lo svantaggio è che ci vuole più tempo per stampare un dato modello e che litografia dip penna necessita di uno strumento specializzato che potrebbe non essere disponibile in molti laboratori. La penna strumento tuffo litografia che abbiamo usato era l'NanoeNabler da Bioforce nanoscienze. Qui, abbiamo stampato piccoli punti che erano <10 micron di diametro, per il quale abbiamo usato SPT10 cantilever.

3a. Microcontact Stampa (μCP) Tecnica

  1. Per pulire e rendere il timbro PDMS più idrofila, trattare lato modellato dei francobolli PDMS in un UV e ozono (per esempio, Procleaner ozono UV Bioforce da Nanoscience) per 1,5 ore. In alternativa, utilizzare un plasmapulitore per un tempo più breve per lo stesso scopo. Questo processo crea una superficie ossidata PDMS 24, che migliora il processo di stampa.
  2. Immediatamente dopo il trattamento con ozono o plasma, luogo e diffondere 10 microlitri di streptavidina (1 mg / ml in PBS) sui francobolli PDMS e lasciare per 1 ora in una camera umida (come parzialmente riempito piastra da 6 pozzetti, vedere il punto 1.3) . Se le tracce dovrebbero essere visibili al microscopio a fluorescenza, utilizzare streptavidina che è coniugato ad un fluorocromo come streptavidina-AlexaFluor350.
  3. Rimuovere streptavidina in eccesso dal timbro con carta velina e asciugare all'aria il timbro per circa 1 min. Premere leggermente il timbro sul PLL-PEG-biotina-rivestite coprioggetto di vetro.
  4. Se streptavidina fluorescente è stata utilizzata in 3.a2 Passo, esaminare lo schema usando sotto un microscopio a epifluorescenza. Conservare le superfici stampate in un essiccatore.

3b. Dip Pen Litografia

  1. Primo, miscelare 1 parte di 1 mg / ml o streptavidina Streptavidin-AlexaFluor350 con 10 parti di glicerolo (v / v) e caricare 5 microlitri della miscela sulla cantilever. Poi inizia il processo di stampa come descritto nel manuale di istruzioni dello strumento litografia dip penna. Per ridurre la dimensione del punto di circa 5 micron, regolare la velocità di stampa, il tempo di contatto del cantilever sulla distanza o superficie verticale del cantilever alla superficie. Nell'esempio illustrato in figura 2c, puntini sono stati stampati in una linea con riga e colonna di separazione impostato a 10-15 micron. Questa distanza è sufficiente per evitare punti di fusione in loro ma permette la visualizzazione di punti multipli in un unico campo di vista con impostazioni maggior microscopio.
  2. Conservare le superfici stampate in un essiccatore.

4. Creazione di sfumature adesivo sul streptavidina-modello Superfici

Creiamo gradienti adesive di biotina-RGD su vetrini rivestiti con streptavidina (Figura 3) o contain modelli streptavidina su vetrini passivato (Figura 5). Per creare un gradiente di superficie, è stato utilizzato un dispositivo disponibile in commercio microfluidica (chiamato sticky-Slide chemiotassi 3D Ibidi) che crea un gradiente stabile soluzione per diffusione passiva. Competere per i siti di legame streptavidina, abbiamo impiegato due opposti gradienti di biotina-RGD e biotina che non era coniugato RGD (vedi Figura 1).

  1. Rispettare le streptavidina rivestite coprioggetto di vetro o con motivi sul lato adesivo del appiccicoso-Slide dispositivo chemiotassi 3D. Per garantire che non vi siano perdite per diverse ore, i bordi del dispositivo sono sigillate con un sottile strato di vaselina riscaldato e con un secondo strato di una miscela di 1 parte di vaselina 1 parte di paraffina (w / w).
  2. Riempire il canale del dispositivo con 6 microlitri PBS nel canale. Quindi riempire i due serbatoi con 70 microlitri di 0,03 mg / pl biotina-4-fluoresceina in PBS e 70 & mu; l di 0,03 mg / pl biotina-RGD in PBS, rispettivamente. Incubare i campioni a temperatura ambiente al buio per 1 ora.
  3. Rimuovere la biotina soluzioni e risciacquare accuratamente la superficie mentre è ancora collegata al dispositivo microfluidico due volte con PBS. Segnare la direzione del gradiente adesivo e, se necessario, lasciare il dispositivo riempito con PBS a 4 ° C per ma assicurare che il dispositivo non si asciughi. Se necessario, analizzare il gradiente adesivo con un microscopio a fluorescenza.

5. Etichettatura di celle con fluorofori per l'imaging cellulare in diretta

Le cellule sono etichettati con coloranti fluorescenti che aiutano il monitoraggio delle cellule sotto il microscopio a fluorescenza. Sonde comuni sono marcatori fluorescenti organelli, come Syto 64 Rosso, che etichetta il nucleo cellulare. Per fare ciò, le cellule vengono prima lavati tre volte con PBS e poi incubate con 1 pM Syto 64 Rosso in terreni di coltura per 45 min ed infine lavato altre tre volte con PBS. Si prega di notare che le cellule non deve esseremantenuto in PBS per lunghi periodi di tempo.

Coloranti alternativi per il monitoraggio delle cellule sono serie CellTracker che macchia il citoplasma e vengono mantenuti durante la migrazione e la divisione cellulare. Trasfezione di cellule con proteina di fusione fluorescente è particolarmente utile per registrare la distribuzione subcellulare di una proteina di interesse durante la migrazione. Tuttavia, proteine ​​fluorescenti tipicamente foto-bleach veloce di coloranti organici così che osservazioni a lungo termine può non essere possibile.

6. Caricamento di celle con una sfumatura solubile nel dispositivo microfluidica

  1. Contare fluorescente cellule marcate e divise in due provette di numero di cellule uguali. Lavare e risospendere un tubo di cellule con supporti contenenti il ​​fattore chemiotattico, come il basso glucosio Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con 10% di siero bovino fetale (FBS). Lavare e risospendere l'altro tubo di cellule nei media senza il chemiotattico, cioè DMEM con 0% FBS. La concentrazione finaledi cellule in ciascun tubo deve essere di 5 x 10 5 cellule / ml.
  2. Rimuovere tutte le soluzioni dal dispositivo microfluidica (dal punto 4.3) e posizionarlo sul palco microscopio (vedi punto 7). Carico 70 microlitri di cellule (5 x 10 5 cellule / ml in DMEM 0% FBS) in un serbatoio e 70 microlitri di cellule HeLa (5 x 10 5 cellule / ml in DMEM 10% FBS) in un altro. Liberamente inserire un nastro sopra i serbatoi per evitare l'evaporazione. Se le cellule sulla superficie sono pre-incubato prima imaging, è opportuno che le cellule vengono caricate nel dispositivo in terreni di coltura senza il gradiente. Il dispositivo viene quindi posto sul piatto microscopio e mezzi sostituito con gradiente supporti cioè DMEM senza FBS in un serbatoio e DMEM con 10% FBS nell'altro.

7. Vivo imaging cellulare e analisi dei dati

  1. Accendere il microscopio (Nikon Ti-E) e riscaldare il palco, almeno 1 ora prima di avviare l'esperimento.
  2. Assicurarsi che il canale del micrDispositivo ofluidic è nel campo di vista e cellule sono a fuoco. Selezionare il parametro di acquisizione immagine, come i tempi di esposizione e filtri fluorescenti, sequenza di immagini del campo chiaro e fluorescenza in grado di catturare le cellule e le tracce così come i punti di tempo e la durata di registrazione (ad esempio ogni 15 minuti per 16 ore).
  3. Analizzare i dati con i software appropriati quali ImageJ Allineamento manuale o Ibidi chemiotassi e strumento di migrazione.

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Risultati

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Per capire come integrare i segnali di cellule migratorie 25, abbiamo sviluppato un metodo per celle di immagine con microscopia a fluorescenza che migrano in un ambiente con concorrenti gradienti adesivi e solubili (Figura 1). Tracce adesive che contenevano streptavidina fluorescente e RGD biotinilato sono stati creati con le tracce microcontatto stampati e litografia dip penna (Figura 2). Stampa microcontact successo è indicato dalla linea profilo dell'intensità di fluoresc...

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Discussione

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In questo protocollo, abbiamo utilizzato un dispositivo disponibile in commercio microfluidica (sticky-Slide chemiotassi 3D Ibidi) per studiare gli effetti delle superfici chimicamente modificati e le sfumature chemoattractant sulla migrazione delle cellule. Questa configurazione microfluidica non richiede un flusso perché il gradiente è stabilito per diffusione lungo la lunghezza del canale. Questo è importante perché il flusso differenziale potrebbe influenzare le cellule migrano lentamente come i fibroblas...

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Dichiarazioni

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Noi non abbiamo interessi commerciali da dichiarare.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono il finanziamento della Australian Research Council e National Health and Medical Research Council of Australia e anche ringraziare la Australian National impianto di produzione per il SU-8 master per la stampa microcontatto. SHN è sostenuta dal Ministero dell'Istruzione Superiore e Malesia Universiti Sains Malaysia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Corredi per la colorazione del vetro di coperturaThomas Scientific8542 E40Portavetrini
RaccoglitorefornoSerie ED 53
Wafer di siliconeSilicon Quest708-007Boro drogato < 100> wafer, diametro 4", 500 μ m,
fotoresist GM1070 SU-8Gersteltec Sarl
SU-8 sviluppatoreGersteltec Sarl
Sylgard 184 agente indurenteDow Corning
Sylgard 184 prepolimero elastomericoDow Corning
PLL-PEG-biotina (20%)SuSos AGPLL(20)-g[3,5]-PEG(2)/PEG(3,4)-biotina (20%)1 mg/ ml in PBS
FluoresceinaSigma469551 mM in PBS
Streptavidina-AlexaFluor350InvitrogenS-112491 mg/ml in PBS
Biotina-4-fluoresceinaInvitrogenB-13700,03 μ g/μ l in PBS
Biotin-RGDGenScriptSC12080,03 mg/ml in PBS
Syto 64 RedInvitrogenS-113461 μ M in PBS
Chemiotassi a vetrino adesivo 3DIbidi80328
200 μ l Greiner punta smussata giallaGreiner Bio-One739261
VaselinaSigma16415
Cera di paraffina, mp 55-57 ° CSigma327204
Nano eNabler 10 μ m cantilever BioForceSPT-S-C-10s
Immagine J softwareNational Institute of Healthrsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking pluginFabrice Cordeliè resrsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Strumento di chemiotassi e migrazioneIbidi GmbHwww.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html
per lucidato su un lato

Riferimenti

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