Articolo metodologico

La registrazione dell'attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

DOI:

10.3791/50312

⸱

30 aprile 2013

 , 
1Department of Physiology, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo video, dimostreremo come registrare l'attività elettrica di singoli neuroni identificati in una preparazione cervello intero, che preserva i circuiti neurali complessi. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con una proteina fluorescente per l'identificazione nella preparazione cervello intatto.

Abstract

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Comprendere la fisiologia delle cellule di circuiti neurali che regolano i comportamenti complessi è notevolmente migliorata utilizzando sistemi modello in cui questo lavoro può essere eseguito in una preparazione intatto cervello in cui i circuiti neurali del sistema nervoso centrale rimane intatto. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con proteina fluorescente verde per l'identificazione nel cervello intatto. I pesci hanno molteplici popolazioni di neuroni GnRH, e le loro funzioni sono dipendenti dalla loro posizione nel cervello e il gene GnRH che essi esprimono 1. Abbiamo focalizzato la nostra dimostrazione GnRH3 neuroni situati nei nervi terminali (TN) associati ai bulbi olfattivi con il cervello intatto del transgenico Medaka pesce (Figura 1B e C). Studi suggeriscono che Medaka TN-GnRH3 neuroni sono neuromodulatori, che agisce come un trasmettitore di informazioni dall'ambiente esterno al sistema nervoso centrale; tehi non svolgono un ruolo diretto nel regolare le funzioni di ipofisi-gonadi, così come il ben noto ipotalamico GnRH1 neuroni 2, 3. L'andamento tonico di azione spontanea potenziale di scarica dei neuroni TN-GnRH3 è una proprietà intrinseca 4-6, la frequenza delle quali è modulata da segnali visivi da conspecifici 2 e il neuropeptide kisspeptin 1 5. In questo video, si usa una linea stabile di Medaka transgenici in cui i neuroni TN-GnRH3 esprimono un transgene contenente la regione del promotore del Gnrh3 legato alla maggiore proteina fluorescente verde 7 per mostrare come identificare i neuroni e monitorare la loro attività elettrica in tutto il cervello preparazione 6.

Protocollo

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1. Dissezione di Brains da adulti Medaka

  1. Anestetizzare adulto di sesso maschile o femminile (Figura 1A) immergendo in 5 ml di MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), attendere un paio di minuti dopo i movimenti branchie hanno cessato prima di decapitare. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa della University of California-Los Angeles.
  2. Decapitare il pesce in soluzione salina di pesce alla fine caudale della opercolo con le forbici in una capsula di Petri del diametro di 60 mm.
  3. Trasferimento testa di pesce ad un diametro piastra di Petri di 35 mm, riempito a metà con il pesce salino e foderato con Sylgard che ha una depressione in esso per posizionare e fissare la testa per la dissezione del cervello. Posizionare e fissare la testa dorso-laterale con perni di insetti.
  4. Tagliare con cautela la parte dorsale del cranio attorno al suo perimetro con le forbici sottili e rimuovere delicatamente con una pinza, esponendo la parte dorsale del cervello compreso completamente la parte anteriore del midollo spinale.
  5. Sollevare il midollo spinale delicatamente con una pinza fine-tip e recidere i nervi connettivi bilaterali con le forbici dalla punta sottile: nervi cranici, nervi spinali e nervi ottici sul lato ventrale del cervello e dei nervi olfattivi presso la parte anteriore del il cervello.
  6. Mettere il cervello completamente sezionato in una capsula di Petri fresco riempito con soluzione fisiologica di pesce e di verificare attentamente al microscopio per assicurare tutto il cervello è intatto (compresa la ghiandola pituitaria), senza tagli o forature. Cervelli danneggiati non vengono utilizzati per la sperimentazione.

2. Montaggio del cervello in una camera di registrazione

  1. Posto una piccola goccia di cianoacrilato o qualche altro colla azione rapida con un ago nel centro della camera di registrazione e diffondere la colla di circa 1 cm 2.
  2. Trasferire rapidamente il cervello e la colla in basso in posizione ventrale up-side.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica pesce in modo da riempire la camera di registrazione e copre il cervello. Continuamente perfusioneil cervello con aerato salina pesce ad una velocità di almeno 200 ml / min.
  4. Utilizzando la messa a punta di pinza rimuovere con attenzione le meningi sulla superficie dell'area di registrazione del cervello.

3. Elettrofisiologia

  1. Allentato registrazione chiazza di potenziale d'azione di cottura
    1. Microelettrodi di vetro (6-10 MW) sono costruiti con pipette in vetro borosilicato (1B150F-4, Strumenti di precisione mondiale) utilizzando un estrattore elettrodo (es. Sutter P-87), e ritorno riempiti con la soluzione di registrazione loose-patch a metà strada su per la elettrodo.
    2. L'utilizzo di un microscopio a fluorescenza in posizione verticale con un dispositivo ad accoppiamento di carica raffreddata (CCD), fotocamera, trovare l'allora obiettivi ad immersione dell'acqua 40x (Figura 1C) GFP che esprimono TN-GnRH3 neuroni attraverso 10x (Figura 1B). Essi sono situati in corrispondenza o in prossimità della superficie ventrale dei bulbi olfattivi, solo anteriori al telencefalo.
    3. Passare a un monitor video che sta fornendoimmagini in tempo reale dal microscopio per individuare il neurone grappolo TN-GnRH3 (Figura 1C).
    4. Posizionare il microelettrodo nel bagno di modo che la punta dell'elettrodo è superiore all'obiettivo neurone. Applicare costante leggera pressione positiva alla microelettrodo modo che non diventi intasato, e avvicinarsi delicatamente il neurone bersaglio con la punta dell'elettrodo.
    5. Controllare e monitorare la resistenza degli elettrodi in modalità voltage-clamp utilizzando il software AxoGraph e amplificatore Axoclamp 200B con il software Axograph (Axon Instruments). Quando si può vedere dal monitor video che la punta dell'elettrodo è sulla superficie del neurone e dal display AxoGraph che la resistenza cambia leggermente, rilasciare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa se necessario, per fare un sigillo bassa resistenza il neurone (<100 MW).
    6. Passare alla modalità corrente-clamp, e registrare la tensione della membrana costantemente senza alcun input corrente, regolando la scaladi tensione e frequenza di registrazione in caso di necessità. I dati vengono raccolti e analizzati dal software Powerlab (ADInstruments Inc.).
    7. Record basale attività elettrica in soluzione fisiologica pesce per circa 5 minuti prima di qualsiasi trattamento (Figura 2A). Bagno perfusione di farmaci, ormoni, peptidi, ecc. aggiunto alla soluzione salina pesce continua alla velocità di 200 ml / min, seguito da un periodo di wash-out in pesce normale soluzione salina 5, 6, 11.
  2. Registrazione cellula intera del potenziale di membrana
    L'intera procedura di patch clamp elettrofisiologia cella è uguale a quello della procedura di registrazione loose-patch extracellulare sopra descritto, da passaggi 3.1.1 - 3.1.4. Poi le procedure discostano di conseguenza:
    1. Controllare e monitorare la resistenza degli elettrodi in modalità voltage-clamp. Quando si può vedere dal monitor video che la punta dell'elettrodo è sulla superficie del neurone e dall'oscilloscopio che la resistenza cambia leggermente, rilasciano il positivopressione e applicare una piccola pressione negativa per fare un sigillo ad alta resistenza sul neurone (~ 3 Giga Ω). Applicare aspirazione delicata per via orale alla rottura della membrana patch, si vedrà un calo improvviso della resistenza a circa 120-250 MW.
    2. Passare alla modalità corrente-clamp, e registrare la tensione della membrana costantemente senza alcun input corrente, regolando la scala di tensione e la frequenza di registrazione, se necessario.
    3. Record basale attività elettrica in soluzione fisiologica pesce per circa 5 minuti prima di ogni trattamento, come sopra descritto in 3.1.7 (Figura 2B).

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Risultati

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Un esempio di cluster bilaterali di GFP-etichettati TN-GnRH3 neuroni dal cervello asportato di Medaka pesci sono mostrati nelle figure 1B e 1C. Ogni cluster contiene circa 8-10 neuroni GnRH. Le attività neuronali spontanee del target TN-GnRH3 sono stati registrati in modalità di corrente-clamp (I = 0) con tassi di cottura tipiche di 0,5-6 Hz. Il modello di potenziale d'azione di cottura è in genere un modello di tonico o battere, con un intervallo di interspike abbastanza regolare. ...

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Discussione

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GnRH 3: GFP transgenici pesci forniscono modelli unici per studiare i meccanismi neurofisiologici alla base di integrazione neuronale e la regolamentazione nel controllo centrale di comportamenti che sono direttamente e indirettamente coinvolti nella riproduzione 3, 8-10. Uno dei vantaggi significativi di questo modello di sistema è che molti GnRH3 neuroni esprimono GFP sono vicini alla superficie ventrale del cervello, consentendo relativamente facile accesso ai neuroni di registrazione elettrofisio...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dott. Meng-Chin Lin e signora Yuan Dong per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health HD053767 (subappalto a NLW), e da fondi del Dipartimento di Fisiologia e Ufficio del Vice Rettore per la Ricerca, l'Università di California-Los Angeles (NLW).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MicroscopioOlympusBX50W (verticale)
AmplificatoreAxon InstrumentsAxoclamp 200B
Convertitore A-DComputer Interference Corp.Digidata ITC-18
Telecamera CCD raffreddataPCO Ottica delSensicam
Lampada allo xenoSutter Instruments Co.
Set di filtri GFP ChromaTechnologies
Software di imagingIntelligent Imaging InnovationsSoftware Slidebook
Software di acquisizione dati per elettrofisiologiaAxon InstrumentsSoftware per assografo
Software di acquisizione dati per elettrofisiologiaAD Instruments Inc.PowerLab
Headstage per elettrofisiologiaAxon InstrumentsCV 203BU
MicromanipolatoreSutter Instrument CoMP-285
Camera di registrazione PiattaformaWarner Instrument Corp.Camera di registrazione P1
Warner Instrument Corp.RC-26G
Estrattore di elettrodiSutter instrumentsP87
Filamento per estrattore di elettrodiSutter InstrumentsFB330BFilamento di canale largo 3,0 mm
Capillari in vetro da 1,5 mmWorld Precision Instruments1B150-4Micr– Lettore per la registrazione
SiringaBecton Dickinson3095863 ml
MS-222 SigmaE10521-10GEtile 3-amminobenzoato metanosolfonato sale
Soluzione salinadi pesce mM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES
Soluzione di elettrodo (loose-patch) mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2.5 CaCl2; 1,3 MgCl2; 10 HEPES; 10
glucosio Soluzione di elettrodi (cerotto a cellula intera) mM: 112,5 K-gluconato; NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 leupeptina; 10 fosfo-creatina
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Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909(2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).

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