Velocimetria immagine Micro-particelle (μPIV) è usato per visualizzare le immagini appaiate di micro particelle seminate nei flussi di sangue, che sono cross-correlato per dare un profilo di velocità accurato. Shear rate, velocità massima, forma del profilo di velocità e portata, ognuno dei quali ha applicazioni cliniche, possono essere derivati da queste misurazioni.
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Articolo metodologico
Micro-Particle Image Velocimetry per Velocity Misure profilo dei flussi Micro sangue
In questo articolo
Sommario
Abstract
Velocimetria immagine Micro-particelle (μPIV) è usato per visualizzare le immagini appaiate di micro particelle seminate nei flussi sanguigni. Le immagini sono cross-correlata per dare un profilo di velocità accurato. Un protocollo è presentato per le misure μPIV di flussi sanguigni nei microcanali. Alla scala del microcircolo, il sangue non può essere considerato un fluido omogeneo, in quanto è una sospensione di particelle in sospensione flessibili nel plasma, un fluido Newtoniano. Gradiente di velocità, la velocità massima, forma del profilo di velocità e portata possono essere derivate da queste misurazioni. Diversi parametri chiave come la profondità focale, la concentrazione di particelle, e la conformità del sistema, vengono presentati in modo da garantire dati accurati e utili con esempi e risultati rappresentativi per le varie ematocrito e le condizioni di flusso.
Introduzione
Il corpo umano contiene numerosi vasi con diametro inferiore a 50 micron, che sono il principale sito di scambio tra sangue e tessuti. Lo studio del flusso sanguigno in questi vasi rappresenta una sfida considerevole sia per la scala delle misurazioni e le proprietà del fluido di sangue. Queste misure, tra cui il gradiente di pressione, il taglio alla parete, e profili di velocità in arteriole e venule, sono fattori chiave collegati con risposte fisiologiche. Ora ci sono opportunità senza precedenti per risolvere queste sfide di misura, grazie alle nuove tecniche sperimentali alla scala micro a studiare il microcircolo e risolvere questo problema multiscala.
Velocimetria immagine Micro-particelle (μPIV) è una tecnica di visualizzazione del flusso di particelle a base che viene utilizzato per valutare i profili di velocità del flusso sanguigno in microcanali tramite correlazione incrociata. μPIV, sviluppato da Santiago et al., è stato utilizzato con EmoreologiaGli studi fin Sugii et al. nel 2001 hanno utilizzato la tecnica per misurare il flusso sanguigno in 100 micron provette rotonde 1,2. Differenti approcci di esistere μPIV. Telecamere ad alta velocità possono essere utilizzate per correlare il movimento dei globuli rossi (RBC), e le immagini pulsate possono essere usate per correlare il movimento delle particelle traccianti. Una di queste opzioni può essere accoppiato con un microscopio diritta o capovolta, a seconda dell'applicazione. In entrambi i casi, il risultato è un profilo di velocità 2D. Un altro approccio è quello di utilizzare un microscopio confocale per realizzare profili 2D e 3D. Questo metodo è stato applicato al sangue 3,4,5.
Micro scala PIV ha diverse complicazioni rispetto alle macro PIV. In macro PIV i dati possono essere limitati ad un singolo piano attraverso i fogli di luce, ma alla micro illuminazione volume di scala è necessario. Illuminazione volume è un problema maggiore per l'imaging di micro flussi ematici, come gli RBC stessi sono grandi in confronto alla channels, quindi con gli RBC come le particelle traccianti porta ad una profondità di correlazione (DOC), che può ridurre notevolmente la precisione dei risultati di cross-correlazione 6,7,8. Seguendo Wereley et al. (1998) la DOC per un canale alto 40 micron con RBC come traccianti è 8.8 micron, mentre con una particella 1 micron tracciante il DOC è 6.7 micron. Questa differenza diventa più pronunciata quando si cambia altezza del canale e l'ingrandimento. Ulteriormente, eritrociti sono opache, e aumentando la densità dei globuli rossi nel flusso provoca difficoltà di imaging. Particelle traccianti fluorescenti, prima usati da (1998) Santiago et al., Sono stati proposti come strumento per diminuire l'influenza delle particelle out-of-focus, quando si utilizzano le particelle più piccole possibili. Utilizzando 1 micron di diametro microparticelle fluorescenti accoppiata con un laser è un approccio che può diminuire la profondità di fuoco in micro problema dell'imaging flusso sanguigno 10. Ci sono diverse recensioni correnti dello stato di μPIV technology, ognuno dei quali mette in evidenza l'importanza di μPIV a studi di flusso di sangue 11,12. Diverse considerazioni importanti devono essere prese in considerazione quando si utilizza μPIV di sangue. A livello micro, la scala del microcircolo, il sangue non può essere considerato un fluido omogeneo, in quanto è una sospensione di cellule flessibili rossi del sangue (RBC), grandi globuli bianchi, piastrine e altre proteine sospese in un fluido Newtoniano (plasma) .
I profili di velocità misurati qui possono essere usati per misurare alcune caratteristiche dei micro flussi sanguigni. I fattori importanti nel microhemorheology sono la velocità di flusso del sangue, la forma del profilo di velocità, e la tensione tangenziale alla parete del vaso. Questa informazione ha implicazioni cliniche, come la microcircolazione è il sito per scambio di nutrienti nel corpo, e questo scambio è shear-dipendente. Ci sono diversi studi revisione in corso sullo stato della ricerca nel microcircolo e 13,14,15.
Presentato qui è un protocollo per le misure μPIV di flussi sanguigni nel polidimetilsilossano (PDMS) microcanali. Canali di PDMS sono stati fabbricati in casa seguendo le fonti in sezione 1 del protocollo. Campioni di sangue di suini sono stati ottenuti da un macello accreditato e puliti dopo la sezione 2 del protocollo. Tutti i dati sono stati ottenuti utilizzando il sistema MITAS μPIV LaVision, come descritto nella sezione 3 del protocollo. Il set-up è costituito da un laser Nd: YAG (New Wave Research, USA) e camera CCD (Immagine intenso, Lavision) comandato da una unità programmabile di attivazione, un microscopio a fluorescenza accoppiato con una fase mobile a tre assi, e un computer, oltre ad una telecamera ad alta velocità (Dalsa 1M150, Paesi Bassi) è stato aggiunto per la visualizzazione dei globuli rossi stessi. Entrambe le telecamere sono collegate ad una scatola ottica 2 porte (personalizzata da Zeiss, Germania). In tipico misure in vivo di flusso di sangue, un microscopio verticale viene utilizzato per tenere traccia dei globuli rossi delmselves, mentre nelle tipiche applicazioni in vitro un microscopio invertito è usato per tracciare le particelle traccianti. In questo doppio unico set-up, la scatola ottica permette entrambi traccianti di essere ripreso con il microscopio invertito. Il sangue è stato introdotto nei microchip mediante una pompa a siringa di alta precisione (Nexus3000, Chemyx Inc., USA). Lo schema del sistema è mostrato in Figura 1, in cui la parte superiore della figura rappresenta il 140 micron da 40 micron canali rettangolari fabbricazione di PDMS, e la porzione inferiore rappresenta l'intero sistema compreso entrambe le fotocamere, il laser, la pompa a siringa e il microscopio.
ΜPIV attuale set-up disponibile, di solito con il software proprietario, includere TSI, Dantec Dynamics, e LaVision. Algoritmi standard cross-correlazione può essere raggiunto attraverso numerose opzioni di software, tra cui il MATLAB. Il software non è la chiave, capire quali sono le finestre di dialogo corrispondono a matematicamente servirà l'usor molto migliore. In questo protocollo Davis, software proprietario di LaVision o MATLAB sono utilizzati. Il protocollo non è un software specifico, ma le opzioni di menu potrebbero essere in luoghi diversi in diversi pacchetti software.
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Protocollo
1. Microchip Fabrication
Il primo passo è quello di creare o acquistare il microcanali. Ci sono molte opzioni per il materiale di microchip.
Uno dei materiali più comuni scelti è poli (dimetilsiloxano) (PDMS). Ci sono molte pubblicazioni su indicazioni per PDMS fabbricazione mediante litografia soft 16,17,18.
Una volta che il canale PDMS è fabbricato, ci sono diversi trattamenti superficiali disponibili a invertire la sua idrofobicità naturale. Trattamento al plasma ossigenato è una scelta comune.
Zhou, Ellis, e Voelcker (2009) danno una revisione dei trattamenti di superficie e come influenzano PDMS. Questi risultati sono per acqua comunque, e sangue ha proprietà diverse. Uno studio su ciò che significa che il trattamento di superficie per il sangue è stato fatto dal (2012a) Pitts et al..
Per i risultati presentati qui, superfici microchip e le lastre di vetro sono statilegato a stati entrambi esposti al plasma ossigenato per 45 secondi e poi pressati insieme saldamente risultante in un legame permanente.
2. Preparazione del sangue
- Raccogliere campioni di sangue da una struttura accreditata. Per esempio sangue suino può essere utilizzato con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) come anticoagulante. Aggiungere 1 g di EDTA con 4 ml di acqua, e quindi aggiungere la soluzione a 1 L di sangue intero, mescolando delicatamente 10x.
Quando raccogliendo campioni di sangue, lasciare raffreddare lentamente a temperatura ambiente. I campioni di sangue devono essere freschi, e utilizzato idealmente il giorno in cui sono raccolti per conservare le proprietà reologiche del sangue.
I campioni possono essere conservati in frigorifero, una volta a temperatura ambiente, ma il sangue intero senza anticoagulante sarà inutilizzabile dopo la refrigerazione. Seconda della anticoagulante, globuli rossi può essere refrigerati per fino a 42 giorni, e il sangue intero può essere conservato in frigorifero per 35 giorni, ma la contaminazione sarebbe possibile in un non-mimpianto edico 21.
Inoltre, fare attenzione al metodo di raccolta con i campioni delle specie bovina o suina, e di evitare la contaminazione da parte del midollo osseo.
- Centrifugare i campioni di sangue 3x a 3.000 rpm per 10 minuti ogni volta. Dopo la prima centrifugazione, rimuovere il plasma e buffy-coat, scartare. E 'generalmente più facile da rimuovere il plasma prima, e poi scartare o conservare per uso futuro, quindi per rimuovere il buffy coat da solo.
Introdurre la pipetta lentamente, così da non mescolare il buffy coat nuovo nel sangue. Dopo aver rimosso il buffy-coat, aggiungere circa 20 ml di tampone fosfato (PBS) e mescolare delicatamente, recentrifuge. Ripetere ultimo passo. Dopo la terza centrifugazione, rimuovere il PBS e il restante buffy-coat, scartare.
È anche possibile utilizzare il plasma nativo invece di PBS, se si desidera mantenere le proprietà aggreganti del sangue. Assicurarsi di non mescolare tutto buffy coat o biancocellule del sangue nel plasma.
- Prendere globuli rossi puliti (RBC) e sospendere in PBS o plasma a concentrazioni desiderate (ematocrito). Controllare ematocrito con una microcentrifuga (CritSpin FisherSci, USA).
Il sangue da 10 a 20% di ematocrito dovrebbe essere più facile da visualizzare del 40 o 50% (fisiologica ematocrito). Nel microcircolo, il sangue è generalmente la metà ematocrito della circolazione macro, quindi H = 20 è adeguata 15.
- Aggiungere particelle traccianti fluorescenti alla concentrazione desiderata per i campioni di sangue. Una regola generale è di avere 10 particelle in una finestra di correlazione, che possono essere calcolati in anticipo.
Per esempio, 30 ml di particelle vengono aggiunti a 1 ml di soluzione di sangue per il set-up rappresentata nel video. In alternativa, i globuli rossi stessi potrebbero essere etichettati con colori fluorescenti.
- Inoltre, fare una soluzione di calibrazione con acqua e influenzaorescing particelle. Sarà necessario calibrare il sistema con una soluzione Newtoniano.
Per esempio, quando si utilizza un obiettivo 10X con un canale sulla scala di 100 um, una concentrazione adatta è 300 ml di particelle mescolati con 15 ml di acqua distillata. Un'altra opzione è quella di utilizzare glicerolo diluito con acqua distillata ad una viscosità di 3cp, che è più vicino alla macro viscosità del sangue.
3. μPIV Misure
- Sicurezza laser: Controllare la temperatura e l'umidità. Indossare occhiali di protezione del laser. Chiudere il sipario laser o accendere il segno laser sulla porta del laboratorio a impedire alle persone non protette di essere esposti.
- Procedura con software Davis è mostrato nel video. Per maggiori dettagli fare riferimento al manuale utente di un sistema specifico.
- Prima di prendere i dati, la scala della fotocamera deve essere calibrato utilizzando un micrometro.
- Per ridurre la conformità del sistema, utilizzare la minor quantità di tubi did la siringa più piccola rigida possibile, ad esempio una siringa a tenuta di gas microlitri Hamilton 15 o 50. Per ridurre la perdita di sangue o presa d'aria nel sistema, sigillare il tubo alla siringa e al chip. Questo può essere fatto con colla, PDMS o vaselina (facendo attenzione a non contaminare il sangue).
Per riempire il micro-siringa con acqua cucita con particelle traccianti utilizzare metodo riflusso perché il volume del micro-siringa è solitamente molto inferiore al volume da riempire.
Il nostro metodo consiste riflusso per riempire il micro-siringa e canale insieme tramite l'uscita del canale utilizzando una siringa di plastica secondario. Per questo, prima rimuovere il micro-stantuffo della siringa, quindi spingere il liquido con la siringa di plastica classica attaccato all'uscita del canale, consentire al liquido fuori il micro-siringa finché tutti microbolle sono fuori del micro-siringa, tubo o Chip, finalmente messo la schiena stantuffo, e staccare la siringa in plastica. La presenza or assenza di microbolle può essere verificata con un microscopio.
- Livellare la pompa a siringa per ottenere tubo orizzontale. Programmare la pompa a siringa a portata desiderata.
Essere consapevoli dei possibili effetti transitori, come l'effetto "collo di bottiglia", per il sistema rigido o la conformità del sistema che modificano la portata effettiva. Tempi caratteristici di un sistema può essere stimata in funzione dei materiali e le dimensioni del sistema. (Capitolo 2, pp 77-81, Tabeling, 2005)
- Posizionare microchip sul palco microscopio e avviare la pompa. Utilizzare l'acqua con particelle di calibrare il sistema al profilo di velocità media e calibrare il dT (il tempo tra le immagini pulsate).
Le particelle devono muoversi tra i 5 ei 10 pixel tra i fotogrammi per una buona correlazione 11. Nella taratura, fare attenzione a misurare nel mezzo del canale. Il piano di fuoco nel mezzo ha la massimavelocity 8.
Se si utilizza un canale circolare, essere attenti di shadowing effetti.
Una immagine di esempio è mostrato in figura 2, utilizzando una fotocamera pulsata, mentre l'immagine in alto è il primo impulso e l'immagine di fondo è il secondo impulso. Si può vedere nella figura che i punti luminosi (particelle fluorescenti) sono i più in-fuoco.
- OPTIONAL: Prendendo dati a diverse altezze profilo di velocità in 3D può essere ricostruito sommando i differenti vettori in una singola immagine. Il video presenta una routine che è stato sviluppato per l'automazione del processo.
- Nel prendere dati con il sangue, riempire la siringa con la quantità desiderata di sangue nello stesso metodo come l'acqua. Programmare la pompa a siringa per la portata desiderata, e prendere dati desiderati. Un esempio di immagini grezzi ottenuti è presentato Figura 2. Fare attenzione di RBC sedimentazione pure. Riempimento della siringa ogni corsa o ognialtra corsa ridurrà l'insediamento del RBC.
- Dopo aver acquisito le immagini, correlazione incrociata è effettuata sulle coppie di immagini per ottenere campi vettoriali di velocità tra le immagini. E 'importante avere buone immagini di avere una buona correlazione. Prima di correlazione, di pre-elaborazione può essere fatto per rimuovere il rumore di fondo.
Correlazione incrociata è fatto tra finestre nelle immagini adiacenti, che possono essere variati in dimensioni e forma di influenzare la correlazione. Dopo la correlazione incrociata, immagine post processing può essere fatto per rimuovere vettori errati o valori anomali.
Una descrizione dettagliata delle diverse opzioni disponibili e le precisioni può essere trovato in Pitts et al. (2012b), dove è stato trovato il miglior trattamento per il sangue di essere il metodo di "immagine overlapping" con finestre estesa in lunghezza e allineato con il flusso . Queste operazioni possono essere eseguite manualmente in un programma come MATLAB, o all'interno del pacchetto software con il sistema. Gli software non è importante, la matematica dietro le operazioni è più importante e ciascuna operazione può influire sulla precisione del profilo di velocità finale.
I vettori risultanti possono essere mediate nello spazio attraverso il canale di ottenere profili di velocità istantanea, media e poi di nuovo in tempo per ottenere un, profilo medio della velocità rappresentante. (2011) Kloosterman et al. Dare una spiegazione dell'errore nelle misurazioni μPIV dove la profondità di campo è grande. Le discussioni su l'errore del trattamento dei dati qui presentati possono essere trovati in (2012b) Pitts et al. Per le misurazioni pulsata e (2012) Chayer et al. Per le misurazioni ad alta velocità.
Esempi di profili di velocità sono presentati nelle figure 3 e 4. Figura 3 presenta un unico profilo di velocità per la mezzeria di una microlitri / hr flusso 10 di RBC H = 10 in un canale largo 140 micron.
tenda "> Questo singolo profilo è ottenuto dalla media dei vettori correlate attraverso il canale per ottenere un profilo di velocità, e quindi media nel tempo per ottenere una misurazione rappresentativa. In questo caso, 100 paia stati mediati nel tempo attraverso il campo di vista.Un esempio del profilo ricostruito 3D preso per un flusso di taratura acqua in un canale quadrato 100 micron con una portata programmata di 30 microlitri / hr è trovato in Figura 4. In figura 4, i profili sono misurati ad intervalli di 1 micron.
- OPTIONAL: Nelle immagini ad alta velocità raffigurati set-up può essere assunto alle stesse condizioni da telecamere di commutazione (e sistemi di acquisizione dati). Ciò può essere utile per la visualizzazione dello strato privo di cellule nel canale, e per quantificare l'aggregazione. L'analisi dei dati è leggermente diversa (Chayer et al., 2012).
Esempi di immagini a luce bianca con e senza RBC aggregazione sono Presented nella Figura 5 a H = 20. Le immagini in alto mostrano H = 20 in PBS, che rimuove la capacità del RBC di aggregare, a 1 ml / hr. L'immagine in basso è H = 20 nel plasma nativo a 0,5 ml / ora. Nell'immagine in basso, aggregazione è visibile.
- Chiudere il sistema in modo sicuro quando sono state completate le misurazioni. Utilizzare le procedure di sicurezza del laser corrette fino fonte di energia del laser è completamente spento.
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Risultati
In tutte le figure, il flusso è da sinistra a destra nelle immagini crude, e verso l'alto in profili di velocità calcolati. Un esempio dei dati grezzi ottenuti con sangue a ematocrito H = 10 fluisce a 10 microlitri / hr è mostrato in Figura 2. I dati grezzi possono essere cross-correlati, senza alcuna elaborazione dei dati per ottenere profili di velocità. L'impatto dei metodi di pre-elaborazione ed elaborazione dati è discussa da Pitts, et al., (2012b). Un esempio di una risultante pro...
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Discussione
Utilizzando μPIV per misure di flusso di sangue alla scala del microcircolo può dare visione in un gran numero di importanti processi di ingegneria biomedica, meccanica e chimica. Alcuni dei fattori chiave per spiegare sono la densità del RBC stessi, l'aggregazione e deformabilità del RBC, aggregazione o movimento delle micro particelle fluorescenti, e l'insediamento dei RBC nei canali. Tutti questi possono essere valutate se le linee guida generali di cui sopra sono seguiti. C'è una lista di controllo di ba...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare NSERC (scienze naturali e ingegneria del Consiglio del Canada) per il finanziamento, Catherine Pagiatikis per il suo aiuto nelle sequenze iniziali, Sura Abu-Mallouh e Federico Fahim per testare il protocollo, Richard Prevost di LaVision, Inc. per il supporto tecnico, e Guy Cloutier dell'Università di Montréal per il prestito della macchina fotografica ad alta velocità Dalsa.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| poli(dimetilsilossano) (PDMS), cioè Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| soluzione salina tamponata con poshpate (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| microparticelle fluorescenti | Microgenics/FisherSci | R900 | |
| glicerolo (OPZIONALE) | Sigma Aldrich | G6279-500 ml | |
| microcentrifuga, i.e. CritSpin | FisherSci | 22-269-291 | |
| siringa, i.e. 50 μ l Fotocamera a tenuta di gas | Hamilton | 80965 | |
| , i.e. Imager Intense, ad alta velocità | LaVision, Dalsa | Imager Microscopio intensivo | |
| , i.e. MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG pompa | New Wave Research | Solo-II | |
| , i.e. Nexus3000 | Chemyx, Inc. | Tubo flessibile Nexus-3000 | |
| , i.e. Tygon | FisherSci | 14-169-1A | |
| software di elaborazione dati, i.e. DaVis | LaVision | DaVis | |
| centrifuga, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F |
Riferimenti
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