Silencing a lungo termine di Intersectin-1s in Polmoni mouse consegna ripetuta di un siRNA specifico tramite liposomi cationici. Valutazione degli effetti Knockdown al microscopio elettronico

Summary

Ripetute iniezioni retro-orbitali di liposomes/siRNA/ITSN-1s cationici complessi nei topi, ogni 72 ore per 24 giorni, fornire in modo efficiente il duplex siRNA per il mouse microcircolo polmonare riducendo mRNA ITSN-1s e di espressione proteica del 75%. Questa tecnica è altamente riproducibile in un modello animale, non ha effetti collaterali ed evita infortuni mortali.

Abstract

Studi precedenti hanno mostrato che knockdown di ITSN-1s (KD _ITSN), una proteina coinvolta nella regolazione endocitico polmone permeabilità vascolare e delle cellule endoteliali (EC) di sopravvivenza, la morte cellulare per apoptosi indotta, un ostacolo importante nello sviluppo di un sistema di coltura cellulare con prolungata ITSN-1s inibizione ^1. Usando liposomi cationici come vettori, abbiamo esplorato il silenziamento del gene ITSN-1s nei polmoni del mouse con la somministrazione sistemica di siRNA mira ITSN-1 gene (siRNA _ITSN). Liposomi cationici offrono diversi vantaggi per la consegna di siRNA: cassaforte con somministrazioni ripetute, nonimmunogenic, non tossico e facile da produrre ^2. Prestazioni liposomi e attività biologica dipendono dalla loro dimensione, carica, lipidi composizione, la stabilità, la dose e la via di somministrazione ³ Qui, efficiente e specifici _ITSN KD in polmoni topo è stata ottenuta utilizzando una combinazione ammonio bromuro dioctadecil colesterolo e dimetil. La consegna per via endovenosadi siRNA _ITSN / cationico complessi liposomi transitoriamente abbattute proteina ITSN-1s e mRNA nei polmoni del mouse al giorno 3, che ha recuperato dopo ulteriori 3 giorni. Sfruttando i liposomi cationici come un vettore sicuro ripetibile, lo studio esteso per 24 giorni. Quindi, il trattamento retro-orbitale con complessi di fresco generato è stato somministrato ogni 3 giorni, inducendo sostenuta _ITSN KD tutto lo studio ^4. Topo tessuti raccolti in diversi momenti post-siRNA _ITSN sono stati sottoposti ad analisi di microscopia elettronica (EM) per valutare gli effetti di KD cronica _ITSN, in endotelio polmonare. Imaging ad alta risoluzione EM ci ha permesso di valutare le variazioni morfologiche causate da KDITSN nel letto vascolare polmonare (cioè rottura della barriera endoteliale, numero di caveolae e sovra-regolazione di vie di trasporto alternative diminuito), caratteristiche non rilevabili al microscopio ottico. Nel complesso questi risultati stabilito un importanteruolo portante di ITSN-1 nella funzione EC e l'omeostasi del polmone, mentre illustra l'efficacia della consegna del siRNA-liposomi in vivo.

Introduction

Nudo siRNA non può penetrare la membrana cellulare, essendo di carica negativa, ed è facilmente degradata da enzimi nel sangue, tessuti e cellule. Recentemente anche con modifiche strutturali per migliorare la stabilità, l'accumulo siRNA presso il sito bersaglio dopo somministrazione è estremamente basso e richiede un veicolo intracellulare efficiente ^5. Liposomi cationici emersi come sicure acidi nucleici vettori con il potenziale per trasferire grandi pezzi di DNA / RNA in cellule incapsulando e proteggendo gli acidi nucleici da degradazione enzimatica ^6. Inoltre, liposomi cationici interagiscono spontaneamente con il DNA / RNA, agevolando....

Protocol

1. Liposomi cationici Preparazione

1. Autoclavare un matraccio pulito a fondo rotondo da utilizzare per la preparazione lipososmes.
2. Preparare soluzioni:
   1. - Sciogliere 200 mg di dimetil ammonio bromuro dioctadecil (Doab) in 10 ml di cloroformio con una piccola bottiglia di vetro.
   2. - Sciogliere 200 mg di colesterolo in 10 ml di cloroformio con una piccola bottiglia di vetro.
   3. - Preparare e sterilizzare in autoclave a 5% di glucosio in 100 ml di RNA / DNA-asi acqua distillata gratuito.
3. Risciacquare il pallone con il cloroformio. Aggiungere 5-10 ml al pallone, agitare e lasciare riposare per q....

Results

Livelli di proteina ITSN-1s e mRNA sono stati monitorati a diversi intervalli di tempo dopo la consegna di siRNA _ITSN mediante Western blot e PCR convenzionale e quantitativa come in ^4. Livelli di proteina ITSN-1s e mRNA in siRNA polmoni del mouse _ITSN trattati erano inferiori di circa il 75% con riferimento ai controlli durante atterramento continuo di ITSN-1s per 21 giorni. Senza ITSN-1s, dynamin-2, un importante partner interagenti del giocatore ITSN-1s ed essenziale in distacco caveo.......

Discussion

Sulla base di studi precedenti pubblicati da altri ⁹ e noi ^{1, 18} abbiamo sviluppato questa metodologia per il lungo termine abbattere di ITSN-1 in vivo per via endovenosa ripetuta (ogni 72 ore, per 24 giorni consecutivi) di specifici siRNA / complessi liposomi. Questo approccio sperimentale è efficiente, può essere utilizzato in modo sicuro e ripetutamente e può essere facilmente esteso per studiare il coinvolgimento di un gene che codifica una qualsiasi proteina di interesse in endotelio .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimetil Diattadecil Ammonio Bromuro (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoStabilizzatore veloce (mini-estrusore)	Avestin Inc.	LF-STB
Membrana in policarbonato, diametro 19 mm, poro 50 nm	Avestin Inc.	LFM-50
Colesterolo	Sigma-Aldrich	C-8667
Cloroformio	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Sali bilanciati di Hank	Sigma-Aldrich	H1387
Pallone a fondo tondo	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - sul bersaglio	Dharmacon/ ThermoScientific	J-046912-11
Pompa peristaltica	Ismatec	REGLO-CDF digitale con testa
Ventilatore	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Acetato di uranile	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Fuori produzione dal produttore
Ossido di propilene	EM Sciences	20400
Stampi per inclusione EM	Sciences	69923-05
Acido tannico	EM Sciences	21710
Tracciante		Preparato in laboratorio come in16
Comments
Dotato di 2 Avestin 1 ml siringhe a tenuta di gas (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
SiRNA modificato, in vivo
Parte di IDEX corp.
D-79232 Marzo, Germania
Sostituito con Embed812, cat. # 14120