GST-la sua purificazione: A Two-step Affinity Purification protocollo Cedendo Full-length proteine ​​purificate

Summary

Nel presente protocollo, si dimostra un metodo altamente efficiente e conveniente purificazione di proteine ​​su piccola scala, che permette la purificazione di proteine ​​ricombinanti, combinando in modo univoco un scindibile GST-tag e un piccolo His-tag.

Abstract

Saggi chiave enzimologia per la caratterizzazione biochimica delle proteine ​​in vitro richiedono alte concentrazioni di proteina purificata di interesse. Protocolli di purificazione di proteine ​​dovrebbero coniugare efficienza, semplicità ed economicità ^1. Qui, descriviamo la GST-His metodo come un nuovo sistema di purificazione per affinità su piccola scala per le proteine ​​ricombinanti, basato su un N-terminale Tag glutatione Sepharose (GST) ^2,3 e un tag 10xHis C-terminale ^4, che sono entrambi fusa per la proteina di interesse. Quest'ultimo costrutto viene utilizzato per generare baculovirus, per infezione di Sf9 cellule infette per l'espressione proteica ^5. GST è piuttosto lunga tag (29 kDa) che serve a garantire l'efficienza di depurazione. Tuttavia, potrebbe influenzare le proprietà fisiologiche della proteina. Quindi, viene successivamente tagliato fuori la proteina usando l'enzima prescissione ^6. Al fine di garantire la massima purezza e per rimuovere la GST spaccati, abbiamoaggiunta una seconda fase di purificazione di affinità basata sul relativamente piccolo His-tag. È importante sottolineare che la nostra tecnica si basa su due diversi tag che fiancheggiano le due estremità della proteina, che è uno strumento efficace per rimuovere le proteine ​​degradate e, quindi, arricchisce proteine ​​integrali. Il metodo qui presentato non richiede una configurazione strumentale costoso, come FPLC. Inoltre, abbiamo incorporato MgCl ₂ e lava ATP per rimuovere le impurità di calore proteina da shock e il trattamento nucleasi per abolire contaminanti acidi nucleici. In sintesi, la combinazione di due diversi tag che fiancheggiano la N-e C-terminale e la capacità di scindere fuori uno dei tag, garantisce il recupero di una proteina altamente purificata e full-length di interesse.

Introduction

La purificazione di proteine ​​ricombinanti è fondamentale per affrontare le questioni fondamentali in biochimica. Modi convenzionali di purificazione delle proteine ​​come cromatografia a scambio ionico e cromatografia ad esclusione dimensionale basano sulle proprietà fisiche della proteina bersaglio come suo punto isoelettrico e carica o dimensione, rispettivamente. Le caratteristiche proteiche ultimi sono condivisi da una varietà di proteine, che aumenta notevolmente la possibilità di proteine ​​contaminanti in strategie di purificazione delle proteine ​​convenzionali. Questo problema può essere aggirato con l'utilizzo di più colonne di purificazione, che rich....

Protocol

1. Produzione di ricombinante Baculovirus

Baculoviruses vengono generati utilizzando il Baculovirus Expression System Bac-to-Bac di Invitrogen prevalentemente secondo il protocollo del produttore con solo lievi modifiche:

1. Un pFastBac1 vettore modificato (Gibco, vita) è stato creato, contenente la GST e suo-tag (Figura 2). Il MultiCloning Site (MCS) di una PET-52b (+) vettore (Novagen), contenente un 10xHis-tag, è stato inserito nel MCS di un vettore pFastBac1 per generare pFastBac1-Strep-10xHis. La sequenza MCS pET-52b (+) è stato amplificato mediante PCR tra i siti di restrizione XbaI e BlpI, l'aggiunta di....

Results

Al fine di illustrare l'efficacia del-His GST protocollo di purificazione, si purificati Rec14, un S. proteine ​​pombe del 32,9 kDa. La Rec14 cDNA è stato clonato nel nostro vettore pFastBac1 modificata permettendo le aggiunte di GST-e le Sue-tag presso la N-e C-terminali, rispettivamente (Figura 1A). Baculovirus ricombinanti sono stati poi preparati e usati per infettare le cellule infettate SF9 per l'espressione della proteina. I lisati cellulari solubili sono stati incubati con perl.......

Discussion

Il GST-His protocollo di purificazione qui presentato è adatto per la purificazione di una vasta gamma di dimensioni di proteine ​​ricombinanti: Abbiamo purificati successo Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), e un alto contenuto di proteine ​​di peso molecolare instabile Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) ^6,9. Inoltre, le proteine ​​purificate con questo protocollo erano biochimicamente attiva ^6. Il successo di questo metodo dipende unicamente dalla espressione.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competente)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Soluzione I e II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
cellule infette da Sf9	ATCC	CRL-1711
Enzima di prescissione	GE Healthcare	27084301
Il mezzo infetto di Grace ha integrato	Gibco (Life)	11605-094
Siero fetale bovino caratterizzato	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillina-Streptomicina)	Gibco (Life)	15070-063
Glutatione Resina di Sefarosio	GE bioscience	17075605
Cocktail di inibitori della proteasi	Roche	11873580001
Talon resina	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicina	Gibco (Life)	15710064
Produzione	interna
policlonali Monoclonali 6X-His-antibody	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce omogeneizzatore (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Sacca per dialisi (50 mm)	Fisher Scientific