Integrato chip microfluidica termoplastico è stato sviluppato per l'utilizzo come diagnostica molecolare. Il chip esegue l'estrazione di acido nucleico, la trascrittasi inversa e PCR. Metodi per la fabbricazione e l'esecuzione del chip sono descritti.
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Articolo metodologico
Chip Fabrication Microfluidic e metodo per rilevare l'influenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diagnostica rapida ed efficace svolgono un ruolo importante nel controllo delle malattie infettive, consentendo la gestione efficace del paziente e del trattamento. Qui, presentiamo integrato chip microfluidica termoplastico con la capacità di amplificare virus in pazienti nasofaringei (NP) tamponi e aspirati. Una volta caricato il campione del paziente, il dispositivo microfluidico esegue sequenzialmente su-chip lisi cellulare, purificazione dell'RNA e concentrazione all'interno estrazione in fase solida (SPE), la trascrizione inversa (RT) e la reazione a catena della polimerasi (PCR) in RT-PCR camere, rispettivamente. End-point di rilevamento è effettuato con un off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Per le periferiche, abbiamo utilizzato una sola pompa siringa per guidare reagenti e campioni, mentre due riscaldatori a pellicola sottile sono stati utilizzati come sorgenti di calore per la PCR e RT camere. Il chip è progettato per essere a singolo strato e adatta per la produzione ad alto throughput per ridurre il fabricatiil tempo e il costo. Il chip microfluidico fornisce una piattaforma per analizzare una varietà di virus e batteri, limitato solo dalle variazioni di progettazione reagenti necessari per individuare nuovi agenti patogeni di interesse.
Introduzione
Milioni di morti sono stati segnalati nel corso delle tre pandemie influenzali del 20 ° secolo 1. Inoltre, la pandemia influenzale più recente è stato dichiarato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) 2 nel 2009, e dal 1 ° agosto 2010, 18.449 decessi sono stati segnalati dall'OMS 3. Questa pandemia dimostrato ancora una volta l'elevato onere delle malattie infettive, e la necessità di una rapida ed accurata di influenza per la conferma rapida della malattia, la risposta del caso la salute pubblica e un trattamento efficace 4.
Ci sono diversi metodi ampiamente utilizzati per ....
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Protocollo
1. Chip Fabrication 12
- Fare due placche da Zeonex pellets 690R: distribuire 8-9 grammi pellets Zeonex uniformemente nel centro di una piastra metallica, preriscaldare il pressa riscaldata a 198 ° C per 5 min, e quindi applicare pressione lentamente a 2500 psi per altri 5 minuti. Per completare questo passaggio, abbiamo usato una pressa a caldo Carver.
- Rilievo il canale microfluidica nella placca con uno stampo epossidica. Dettagli sulla fabbricazione dello stampo sono descritte altrove 12 (disegno del canale in Figura 2b): posizionare una placca sullo stampo epossidico; preriscaldare loro sulla pressa riscal....
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Risultati
Un tipico risultato è mostrato in Figura 3 per un influenza A esemplare infetto lavaggio nasofaringeo. A causa delle diverse quantità di virus dell'influenza in ogni campione, la concentrazione finale del prodotto di PCR varierà. Un buon risultato deve avere basso rumore, due picchi scaletta chiari (35 e 10.380 bp) e un picco singolo prodotto con le dimensioni prodotto progettato (107 bp) per il campione positivo. Mentre il picco prodotto teoricamente dovrebbe essere assente per i controlli ne.......
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Discussione
Il metodo diagnostico presentato qui dimostrato la capacità di un sistema integrato chip microfluidica plastica per amplificare influenzali RNA da campioni di pazienti con alta specificità e un limite di rilevabilità basso 13 Abbiamo progettato questo chip per potenziale punto di testing cura:. (A) la temperatura e fluidici controllo sono state semplificate, (b) il chip è a basso costo e adatto per fabbricazione ad alta con stampaggio ad iniezione, e (c), il chip è monouso e previsto per un solo uso, riducend.......
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Dichiarazioni
Gli autori hanno dichiarato alcun conflitto di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (NIH) concessione R01 EB008268.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / materiale | Azienda | Numero di catalogo | |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-dimetossi-2-fenilacetofenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-propanolo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Metacrilato di butile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cicloesanolo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105.899-1L | |
| Etanolo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Etilene dimetacrilato | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Glicole etilenico dimetacrilato | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Vetro siringa 250 microlitri | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidina tiocianato | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity Kit DNA | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Stampa a caldo | Carver, Wabash, IN | 4386 | |
| JB Weld Epossidiche | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok siringhe | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Cloruro di magnesio | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Metanolo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Metacrilato di metile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch scientifico | N-333-01 | |
| Nanoport Raccordo | Upchurch scientifico | F-120x | |
| Acqua priva di nucleasi | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | PR-p1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Alimentazione | VWR, Radnor, PA | 300V | |
| RNAsi in trasferta | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Microsfere di silice | Polysciences, Warrington, PA | 24324-15 | |
| Pompa a siringa | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Nastro termoconduttivo | McMaster-Carr, Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Termocoppia | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| A film sottile Riscaldatori | Minco, Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Crosslinker Ultraviolet | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
Riferimenti
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organ....
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Ristampe e permessi
