Per studiare i cambiamenti di fibre nervose nocicettive intraepidermiche (IENFs) nelle neuropatie dolorose (PN), abbiamo sviluppato protocolli che potrebbe esaminare direttamente le variazioni morfologiche tridimensionali osservati in IENFs nocicettivi. Analisi tridimensionale IENFs ha il potenziale di valutare le variazioni morfologiche del IENF in PN.
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Articolo metodologico
Imaging tridimensionale di fibre nervose nocicettive intraepidermiche in biopsie cutanee umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una biopsia della pelle è comunemente utilizzato per quantificare intraepidermiche densità delle fibre nervose (IENFD) per la diagnosi di polineuropatia 1,2 periferico. Attualmente, è pratica comune per raccogliere 3 millimetri biopsie dalla gamba distale (DL) e la coscia prossimale (PT) per la valutazione di polyneuropathies lunghezza-dipendenti 3. Tuttavia, a causa della natura di IENFs multidirezionale, è impegnativo per esaminare sovrapposizione strutture nervose attraverso l'analisi di formazione immagine bidimensionale (2D). Alternativamente, l'imaging tridimensionale (3D) potrebbe fornire una soluzione migliore per questo dilemma.
Nella presente relazione, presentiamo i metodi per applicare l'imaging 3D per lo studio neuropatia dolorosa (PN). Per identificare IENFs, campioni di pelle vengono elaborati per l'analisi di immunofluorescenza di proteine prodotto genico 9.5 (PGP), un marcatore neuronale padella. Al momento, si tratta di una pratica standard per la diagnosi di piccole neuropatie in fibra con IENFD scoraggiareminato da PGP immunoistochimica utilizzando campo chiaro microscopia 4. In questo studio, abbiamo applicato all'analisi doppia immunofluorescenza per identificare IENFD totale, utilizzando PGP, e IENF nocicettiva, attraverso l'uso di anticorpi che riconoscono tropomiosina-recettore-chinasi A (Trk A), il recettore ad alta affinità per il fattore di crescita nervosa 5. I vantaggi di co-colorazione IENF con anticorpi A PGP e Trk avvantaggia lo studio del PN dalla colorazione chiaramente PGP-positivi, le fibre nocicettive. Questi segnali fluorescenti possono essere quantificati per determinare nocicettivi cambiamenti IENFD e morfologiche IENF associate a PN. Le immagini fluorescenti sono acquisite da microscopia confocale ed elaborati per l'analisi 3D. 3D Imaging fornisce capacità di rotazione per analizzare ulteriormente i cambiamenti morfologici associati a PN. Nel loro insieme, fluorescente co-colorazione, confocale e analisi 3D chiaramente beneficiare studio della PN.
Introduzione
Allo stato attuale, è pratica comune per i medici di quantificare intraepidermiche densità delle fibre nervose, (IENFD) da biopsie cutanee, che possono essere utilizzati per diagnosticare piccole neuropatie fibra 3, 6-8. Le biopsie sono presi dalla gamba distale (DL), 10 cm sopra il malleolo laterale, e la coscia prossimale (PT), 20 cm al di sotto della spina iliaca anteriore 9. Tutto IENF vengono etichettati utilizzando prodotto gene della proteina 9.5 (PGP), un marker neuronale padella 10-12. Al momento, si tratta di una pratica standard per la diagnosi di piccole neuropatie in fibra con IENFD determinata colorando PGP con campo chi....
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Protocollo
Parte A: Immunoistochimica
Preparazione della piastra a 96 pozzetti e la prevenzione di colorazione di fondo Punch biopsie cutanee sono raccolti da soggetti umani e incubato per 12-24 ore in una soluzione di fissativo (paraformaldeide al 2% con 0,75 M soluzione di L-lisina (pH 7.4) e 0,05 mm di sodio periodate) a 4 ° C, come descritto in precedenza 8. I campioni vengono poi crioprotetti in tampone fosfato (PBS) con il 20% di glicerolo a 4 ° C per un massimo di 1 settimana, incorporato nel supporto di montaggio della temperatura ottimale di taglio (OCT), poi sezionato in 50 micron sezioni spesse su un criostato. Il protocollo descr....
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Risultati
Abbiamo applicato l'attuale protocollo per studiare la morfologia di IENF in PT e DL biopsie cutanee di pazienti con PN. La pelle, da tre soggetti, è stato raccolto presso l'Università dello Utah per dimostrare la Pathomorphology associata a PN. I soggetti sono: Caso 1: un 51-anno-vecchio maschio con una storia di PN di diabete di tipo 2 (durata: 14 mesi; punteggio del dolore: 51); Caso 2: un 56-anno-vecchio maschio con una storia di PN di diabete di tipo 2 (durata: 108 mesi; punteggio del dolore: 47), e causa 3.......
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Discussione
Misurazione di IENFD è stato ampiamente utilizzato per determinare il grado di neuropatie periferiche 13,14. Attualmente, il protocollo più comunemente usato misura solamente le densità di fibre nervose che penetrano la membrana basale dell'epidermide, ma non prende in considerazione ramificazione assonale e / o modifiche morfologiche dei nervi. Inoltre, l'analisi IENFD corrente non ha mostrato di correlare IENFD con la presenza di dolore in PN 15.
Abbiamo prece.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interesse a dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni K08 NS061039-01A2, il Programma per Neurology Research & Discovery, e The A. Alfred Taubman Medical Research Institute presso l'Università del Michigan. Questo lavoro utilizza la Morfologia e Image Analysis Nucleo del Michigan Diabetes Research e centro di formazione, finanziato dal National Institutes of Health di Grant 5P90 DK-20572 presso l'Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali. Gli autori desiderano ringraziare Robinson Singleton e Gordon Smith (University of Utah) per la generosa donazione di campioni di pelle umana per sostenere lo sviluppo iniziale dell....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | Per comporre 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Coniglio policlonale) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomiosina correlata-Kinasi A (capra policlonale) | R& D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 asino &alfa;-coniglio | Invitrogen | A21206 | AF488 asino &alfa;-capra |
| Alexa Fluor 647 asino &alfa;-capra | Invitrogen | A21447 | AF647 asino α-capra |
| Albumina, da siero bovino | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| inoculante | Loop LeLoop | MP 199025 | non calibrata |
| Corning Incorporated | 3603 | pozzetti | |
| Reagente antisbiadimento Prolong Gold con DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| DAPI Vetro di copertura per microscopio 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Vetrini coprioggetti |
| Superfrost Plus Fisher | Scientific | 12-550-15 | Vetrini per microscopio |
| Microscopio confocale a scansione laser Olympus Fluoview Microscopio confocale | Olympus | FV500 | |
| Temperatura di taglio ottimale | Sakura | 4583 | OCT |
| Criostato Leica | CM1850 |
Riferimenti
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis
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Ristampe e permessi
