Le proprietà paramagnetiche di emozoina sono utilizzati per isolare fasi avanzate della Plasmodium falciparum-Infetti globuli rossi crescono in coltura. Il metodo è semplice e veloce e non influenza le capacità invasive successive dei parassiti.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
A differenza di altre specie di Plasmodium, P. falciparum possono essere coltivate in laboratorio, che facilita lo studio 1. Mentre la parassitemia ottenuto può raggiungere il limite ≈ 40%, l'investigatore tiene normalmente la percentuale intorno al 10%. In molti casi è necessario isolare il parassita contenenti globuli rossi (RBC) da quelli non infetti, ad arricchire la cultura e procedere con un dato esperimento.
Quando P. falciparum infetta il eritrociti, il parassita si degrada e si nutre da emoglobina 2, 3. Tuttavia, il parassita deve fare i conti con una molto tossica contenente ferro eme parte 4, 5. Il parassita sfugge sua tossicità trasformando l'eme in un polimero a cristalli inerte chiamato haemozoin 6, 7. Questa molecola contenente ferro viene memorizzato nel suo vacuolo alimentare e il metallo in esso ha uno stato ossidativo che differisce da quella in eme 8. Stato ferrico di ferro nel emeozoin le conferisce una proprietà paramagnetica assente negli eritrociti non infetti. Come il parassita invade raggiunge la maturità, il contenuto di haemozoin aumenta anche 9, che conferisce paramagnetismo ancora di più le ultime fasi di P. falciparum all'interno degli eritrociti.
Sulla base di questa proprietà paramagnetica, le ultime fasi di P. falciparum infetto-globuli rossi possono essere separati facendo passare la cultura attraverso una colonna contenente biglie magnetiche. Queste perle diventare magnetico quando le colonne che li contengono sono disposti su un supporto magnetico. RBC infetti, a causa della loro paramagnetismo, verrà intrappolata all'interno della colonna, mentre il flusso attraverso conterrà, per la maggior parte, eritrociti infetti e quelle contenenti fasi iniziali del parassita.
Qui, descriviamo la metodologia per arricchire la popolazione di parassiti fase avanzata con colonne magnetiche, che mantiene una buona redditività parassita 10.Dopo aver eseguito questa procedura, la cultura distaccato può essere restituito ad un incubatore per consentire ai parassiti rimanenti per continuare a crescere.
Protocollo
Tutte le fasi del protocollo, tranne per centrifugazioni, deve essere effettuato all'interno di una cappa di mantenere il campione sterile.
1. Fase tardiva isolamento di P. falciparum con infezione da Eritrociti
Tutte le fasi tardive di eritrociti infettati dal Plasmodium possono essere separati con questa metodologia, in quanto emozoina, che conferisce paramagnetismo sul parassita, è un metabolita comune al genere. Una parassitemia elevata (3-10%) nella cultura si consiglia di ottenere i migliori rendimenti con questo protocollo, anche se una cultura tipica conterrà 2-4% dell'ematocrito (percen....
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Risultati
In figura 2, la cultura passa attraverso la colonna magnetica viene mostrato, prima (A) e dopo il procedimento (B). Uno a due eritrociti infetti sono di solito visto su un campo ingrandimento 100X, come mostrato in figura 2, con le frecce rivolte verso eritrociti infetti in Figura 2A. In una tipica procedura, a partire da una coltura al 5% parassitemia (Figura 2A), le prestazioni di questo procedimento produce solitamen.......
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Discussione
Nelle culture in vitro di parassita della malaria P. falciparum mostrano una parassitemia limitata, con più della metà dei globuli rossi non infettate nel punto più alto proliferazione di cultura. Per esperimenti più ricerca, è desiderabile lavorare solo con gli eritrociti infetti. A tal fine, una tecnica di separazione è necessario dividere la coltura secondo l'infezione. Metodi utili includono l'uso di streptolisina O a permeabilize e Lyze gli RBC non infetti 11 e una seri.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione PRB-009 per CS e una borsa di studio di dottorato di LC, dal Nacional Secretaría de Ciencia y Tecnología (SENACYT), Panama.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| RPMI 1640 Hepes modifica | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplementato con 10% di siero umano, 2% di glucosio, bicarbonato di sodio e 0,2% |
| MidiMACS separatore | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Colonne | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Emocitometro | Grafco | Grafco Neubauer Camera | Può essere trovato in molti altri fornitori |
Riferimenti
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E.
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Ristampe e permessi
