Misurare intracellulare Ca 2 + Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l'imaging cellulare

Summary

Intracellulare di Ca ^{2 +} Dinamiche sono molto importanti in sperma fisiologia e Ca ^{2 +} Sensibili coloranti fluorescenti costituiscono uno strumento versatile per studiarli. Esperimenti di popolazione (fluorometria e fermato il flusso fluorometria) ed esperimenti cella singola (citometria a flusso e l'imaging di singola cellula) sono utilizzati per tenere traccia spazio-temporale [Ca ^{2 +}] Cambiamenti nelle cellule di sperma umano.

Abstract

Gli spermatozoi sono cellule riproduttive maschili specialmente progettati per raggiungere, riconoscere e fondersi con l'uovo. Per eseguire queste attività, gli spermatozoi devono essere preparati ad affrontare un ambiente in costante evoluzione e per superare le numerose barriere fisiche. Essere in sostanza transcriptionally e translationally silenziosa, queste cellule mobili affidano profondamente su diversi meccanismi di segnalazione di orientarsi e di nuotare in modo diretto, e fare i conti con le difficili condizioni ambientali durante il loro viaggio per trovare l'uovo. In particolare, Ca ^{2 +-mediata} segnalazione è fondamentale per diverse funzioni spermatiche: attivazione della motilità, capacitazione (un processo complesso che prepara lo sperma per la reazione acrosomiale) e la reazione acrosomiale (un evento esocitotico che permette la fusione spermatozoo-uovo). L'uso di coloranti fluorescenti per monitorare fluttuazioni intracellulari di questo ione è di notevole importanza per la loro facilità di applicazione, sensibilità e versatilità di detezione. Utilizzando un unico protocollo di colorante di caricamento utilizziamo quattro diverse tecniche di fluorimetrici per monitorare lo sperma Ca ^{2 +} dinamica. Ciascuna tecnica fornisce informazioni distinta che consente la risoluzione spaziale e / o temporale, generando dati sia a singola cella e di popolazioni cellulari.

Introduction

Ca ^{2 +} è un secondo messaggero universale di vie di trasduzione del segnale in cellule eucariotiche. Intracellulare di Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) partecipa alla regolazione di molti processi fisiologici fondamentali nelle cellule sia eccitabili e non eccitabili. L'importanza e l'universalità di Ca ^{2 +} come secondo messaggero durante eventi di trasduzione del segnale è derivato dalla sua versatilità spazio-temporale nella trasmissione delle informazioni all'interno della cellula. Mentre Ca ^{2 +} non possono essere sintetizzati de novo o degradati all'interno della cellula, la sua concentra....

Protocol

In questo articolo riportiamo l'utilizzo delle quattro summenzionate tecniche per misurare la [Ca ^{2 +]} _i cambiamenti nelle cellule di sperma umano. Abbiamo usato progesterone per innescare una risposta di Ca ^{2 +,} in quanto è noto che questo steroide produce un transitorio [Ca ^{2 +]} _i in spermatozoi. In particolare, in sperma umano, progesterone attiva direttamente un canale Ca ^{2 +} (ossia CatSper) espresso esclusivamente nella membrana plasmatica di cellule spermatiche ^10,11. Abbiamo anche misurato riposo [Ca ^{2 +]} _i, prima e dopo la capacitazione dato che è anche ampi....

Results

Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale per la preparazione dei campioni di sperma con il metodo semi-sommerso. Le fasi principali per la separazione di spermatozoi mobili e per la regolazione della loro concentrazione sono illustrate. L'ultimo passaggio di incubazione viene eseguita solo quando è .......

Discussion

Segnalazione intracellulare è di vitale importanza per la maggior parte delle attività cellulari; Ca ^{2 +} è un messaggero ubiquitario che accompagna le cellule di mammiferi in tutto il loro intero ciclo di vita, dalla loro origine alla fecondazione, alla fine del loro ciclo di vita. In risposta a stimoli diversi, [Ca ^{2 +]} i aumenta, oscilla e diminuisce con codificazione spazio-temporale, di conseguenza, diversi processi sono attivati, modulate o denuncia da parte di Ca ^{2 +} messaggi codif.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A-7906
Cloruro di calcio diidrato circa 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Camera di conteggio Makler	SEFI Medical Instuments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 fiale/50 μ g ciascuno
Ionomicina	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)
Bicarbonato di sodio	JT Baker	3506	Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)
Cloruro di calcio anidro	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)
D-Glucosio	JT Baker	1906-01	Reagenti per spermatozoi umani medium (HSM)
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)
L-lattato di sodio (circa 99%)	Sigma-Aldrich	L-7022	Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)
Ioduro di propidio	Invitrogen	L-7011	Componente B
Triton X-100 (t-Ottilfenossipolietossietanolo)	Soluzione Sigma-Aldrich	X-100	2.4 mM in acqua
Vetrino coprioggetti rotondo	VWR	48380 080	25 mm di diametro
Soluzione di poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920
Cloruro di manganese	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Camera cellulare, per microscopia	Life technologies	A-7816
Dimetil solfossido	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml