In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Sommario

Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e reagenti, C. elegans Rende un organismo modello ideale per In vivo Di imaging neuronale utilizzando relativamente semplici, tecniche a basso costo. Qui si descrive l'imaging singolo neurone in animali adulti intatti usando geneticamente codificati indicatori di calcio fluorescenti.

Abstract

Il verme nematode C. elegans è un organismo modello ideale per relativamente semplice, a basso costo di imaging neuronale in vivo. Suo piccolo corpo trasparente e semplice, ben caratterizzato sistema nervoso consente l'identificazione e l'imaging di fluorescenza di ogni neurone all'interno dell'animale intatto. Tecniche di immobilizzazione semplici con un impatto minimo sulla fisiologia dell'animale consentono esteso time-lapse imaging. Lo sviluppo di geneticamente codificati fluorofori calcio sensibili come cameleon ¹ e ² permettono GCaMP immagini in vivo di calcio neuronale relative sia fisiologia cellulare e l'attività neuronale. Numerosi ceppi transgenici che esprimono questi fluorofori in neuroni specifici sono prontamente disponibili o possono essere costruiti utilizzando tecniche ben consolidate. Qui si descrivono le modalità dettagliate per la misura della dinamica del calcio all'interno di un singolo neurone in vivo usando sia GCaMP e cameleon. Discutiamo vantaggi e disadvantetà di entrambi, nonché vari metodi di preparazione del campione (immobilizzazione animale) e analisi di immagine. Infine, vengono presentati i risultati di due esperimenti: 1) Uso GCaMP per misurare la risposta sensoriale di un neurone specifico ad un campo elettrico esterno e 2) Uso cameleon misurare la risposta fisiologica di calcio di un neurone laser a danni traumatici. Tecniche di imaging di calcio come questi sono ampiamente utilizzati in C. elegans e sono stati estesi alle misure in animali liberi di muoversi, i neuroni contemporaneamente e confronto tra background genetico. C. elegans presenta un sistema robusto e flessibile per imaging in vivo neuronale con vantaggi rispetto ad altri sistemi modello semplicità tecnica e costo.

Introduzione

Qui vi presentiamo metodi pratici per imaging in vivo di calcio in C. elegans neuroni. Lo sviluppo di geneticamente codificati calcio-sensibili fluorofori con elevato rapporto segnale-rumore rende C. elegans un sistema relativamente semplice e conveniente per la misurazione di neurofisiologia e di attività. La nostra immagine è fatta con un microscopio standard con largo campo imaging di fluorescenza dei fluorofori comunemente disponibili. Vi presentiamo diverse tecniche che impiegano fluorofori diversi e preparati di campionamento diverse, discutendo i punti di forza e di debolezza di ciascuno. I dati vengono quindi presentato da due esper....

Protocollo

1. Configurazione ottica

1. Utilizzare un microscopio standard composto con capacità di imaging epifluorescenza. Usiamo un Nikon Eclipse Ti-U microscopio invertito con un illuminatore Intensilight HG.
2. Per una migliore immagine e la qualità del segnale utilizzare un alto ingrandimento, obiettivo di alta apertura numerica. Si utilizzano in genere un obiettivo Nikon X60 1,4 olio NA immersione. In alcuni casi è possibile usare più basso ingrandimento (X40, X20) a seconda del livello di espressione del fluoroforo e la forza del segnale.
3. Utilizzate una sensibilità elevata raffreddato CCD, come ad esempio una telecamera Andor Clara per massimizza....

Risultati

Qui vi presentiamo i risultati di due esperimenti separati. Il primo impiega GCaMP misurare la risposta di un neurone specifico a uno stimolo sensoriale definito esterno, dando un buon esempio di come reporter di calcio fluorescenti può essere utilizzato per monitorare l'attività neuronale in otticamente intatta C. elegans. Il secondo impiega cameleon misurare il calcio intracellulare transiente attivato entro un neurone in risposta al danno laser specifico, illustrando così come fisiologia calcio può esser.......

Discussione

Indicatori calcio geneticamente codificati sono stati ampiamente utilizzati in C. elegans neurobiologia. Numerosi gruppi hanno utilizzato queste tecniche per studiare la risposta dei neuroni sensitivi primari a stimoli esterni come dimostrato qui con la risposta ASJ ad un campo elettrico. Esempi più evidenti riguardano sensazione del tatto meccanici, prodotti chimici specifici, la temperatura e un campo elettrico ^{12, 16-19.} Attività di interneuroni e cellule muscolari sono stati monitorati sia in ris.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Eclipse Ti-U invertito	Nikon
Intensilight HG Illuminator	Nikon	C-HGFI	Sorgente luminosa fluorescente
CFI Plan Apo VC 60X Oil	Nikon
Tavolo ottico o breadboard ottica 3'X3'	Thor Labs		Se non si utilizza un tavolo ottico, una breadboard di grado ottico su un solido banco da laboratorio dovrebbe sufficiente.
	interlinea Clara	Tecnologia Andor	Telecamera CCD ad alta sensibilità
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	Set di filtri GFP per imaging Filtro GCaMP
440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	filtro di eccitazione per cameleon
Specchio dicroico > 455 nm passatempo lungo	Chroma	455DCLP BS	microscopio dicroico per imaging cameleon
Specchio dicroico > 515 nm passatempo lungo	Chroma	515DCLP BS	specchio dicroico per cameleon filtro imaging
535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m Filtro	di emissione EM YFP
Filtro 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m	Filtro di emissione EM CFP
Lens, 200 mm, Achromat	Thor Labs	AC508-200-A1	Lente relè per ottica FRET (3)
Specchio a banda larga argento	Thor Labs	ME2S-P01	Ottica FRET (2)
Buffer
Levamisole	Sigma
Polybead Microsfere	Poliscienze, Inc.	08691-10, 2,5% per volume, 50 nm di diametro	nanoparticelle di polistirene per C. elegans immobilizzazione
Ceppo transgenico, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Ceppo PS6388
Ceppo transgenico, mec- 4::YC3.60	Gabel	Ceppo da laboratorio CG1B

microscopio Telecamera NGM