Articolo metodologico

Isolamento, elaborazione ed analisi dei murini gengivali

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DOI:

10.3791/50388

⸱

2 luglio 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Dental Sciences, Hebrew University - Hadassah Medical Center, 2Department of Periodontology, Hebrew University - Hadassah Medical Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive una tecnica efficiente per isolare e processare tessuti gengivali dalla cavità orale topo per produrre una coltura cella singola. Le cellule risultanti possono essere ulteriormente utilizzati per l'analisi di citometria a flusso e studi molecolari.

Abstract

Abbiamo sviluppato una tecnica per isolare e processare murino tessuto gengivale per la citometria a flusso e studi molecolari con precisione. La gengiva è un tessuto unico e importante per studiare i meccanismi immunitari perché è coinvolto nella risposta immunitaria contro i biofilm orale che potrebbe causare malattie parodontali. Inoltre, la vicinanza della gengiva al tessuto osseo alveolare consente anche studiando rimodellamento osseo in condizioni infiammatorie. Il nostro metodo consente di ottenere grandi quantità di cellule del sistema immunitario che permette l'analisi anche di popolazioni di cellule rare, come le cellule di Langerhans e le cellule T regolatorie, come abbiamo dimostrato in precedenza 1. Impiegando i topi per studiare le risposte immunitarie locali coinvolti nella perdita di osso alveolare durante la malattia parodontale è vantaggioso a causa della disponibilità di vari strumenti immunologici e sperimentali. Tuttavia, a causa della loro piccola dimensione e l'accesso relativamente scomodo per la gengiva murino, molti studi evitati esame di this tessuto critico. Il metodo descritto in questo lavoro potrebbe facilitare l'analisi gengivale, che si spera di aumentare la nostra sottovalutare sul sistema immunitario orale e il suo ruolo durante le malattie parodontali.

Introduzione

Gengiva è il tessuto molle che circonda la porzione cervicale dei denti e copre il processo alveolare (Figura 1). La gengiva è un tipo di mucosa masticatoria che può essere ulteriormente separato in epitelio mucoso e tessuto connettivo (noto anche come sottomucosa o lamina propria). La struttura anatomica della gengiva e denti adiacenti permette ai batteri di risiedere e sviluppare placche (biofilm) che sfida costantemente il sistema immunitario locale. Come risultato, risposta infiammatoria sviluppa nella gengiva, che in talune circostanze diventa distruttiva - una condizione nota come malattie periodontali 2. In sostanza, patologie parodontali placca indotte possono essere suddivisi in gengivite e parodontite. La gengivite rappresenta una condizione reversibile della risposta infiammatoria locale che si limita alla gengiva. Periodontite, d'altra parte, è un processo distruttivo irreversibile in cui l'apparato di attacco (osso alveolare, parodontalelegamento, cemento e gengiva) è distrutto 3.

La gengiva è stato proposto per servire siti sia come effettori e induttivi durante malattie parodontali 4. Studi sull'uomo hanno suggerito che in risposta alla placca dentale, le cellule immunitarie effettrici e le molecole infiltrate o di partenza la gengiva 5-7 dinamicamente. Questa attività ha dimostrato di svolgere un ruolo importante nella distruzione parodontale 8,9. Considerando che i dati generati da questi studi hanno fornito informazioni importanti per quanto riguarda questo processo patologico, lavorando con i tessuti umani possiedono grandi limiti etici, tecnici e sperimentali. Lo sviluppo di modelli sperimentali animali sperimentazioni di causa-effetto con l'impiego topi transgenici e negli interventi in vivo 10. Come risultato, le nostre conoscenze sui meccanismi coinvolti nella malattia parodontale è aumentato notevolmente nel corso degli ultimi due decenni. Anche così, a causa della complessità delle malattie periodontali, c'èun dibattito in corso in merito alla natura della risposta immunitaria locale facilitando la distruzione dei tessuti. Vi è anche una mancanza nella nostra comprensione sulla funzione delle cellule immunitarie centrali nella gengiva durante malattie periodontali. E 'quindi essenziale studiare eventi infiammatori patologici che si verificano nel tessuto bersaglio della malattia, la gengiva.

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Protocollo

Preparare in anticipo:

  • PBS + 2% FCS
  • PBS + 2% FCS con 2 mg / ml di collagenasi di tipo II e 1 mg / ml di DNAsi tipo I (1 ml per campione)
  • Strumenti chirurgici sterilizzati
  • 0,5 M soluzione di EDTA

1. Tomaia gengivale Tecnica escissione

  1. Euthanize topo, utilizzando una guida IACUC approvato.
  2. Tagliare entrambi i lati del cavo orale tra le guance e il ramo mandibolare con un secco / smussato forbici dritte.
  3. Tirare verso il basso la mandibola.
  4. Tagliare i tessuti molli e duri in una linea immaginaria 1 millimetro dietro i molari terzi con forbici normali. Dirigono le forbici perpendicolari al piano dell'osso palatale (Figura 2A, linee blu).
  5. Incidere i tessuti molli e duri 2 millimetri dietro gli incisivi (Figura 2A, linee blu).
  6. Tirare verso il basso la parte anteriore della bocca. La cavità nasale è osservabile dopo questo passaggio.
  7. Posizionare le forbiciparallelo al palato, mettere una lama nella cavità nasale, l'altra lama deve incidere al vestibolo. Tagliare finché l'incisione posteriore (Figura 2A, linee verdi). Ripetere questo passaggio su entrambi i lati del mascellare superiore. Alla fine del mascellare è staccata dal resto del cranio (Figura 2B).
  8. Rimuovere la mascella, tagliarlo nella sutura centro (Figura 2, nero linea tratteggiata) e tagliare il tessuto palatale di ciascun emi-mascellare fino a raggiungere l'osso alveolare.
  9. Sbucciare i tessuti gengivali (sia emi-mascellari) dal loro margine anteriore con Adson pinza (senza denti).
  10. Posizionare la gengiva asportato in un piatto con PBS + 2% FCS.

2. Gengivale Elaborazione

  1. Mettere la gengiva asportato in un piatto di coltura tissutale (35 x 10 mm) con 1 ml di PBS + 2% FCS, 2 mg / ml di collagenasi di tipo II e 1 mg / ml di DNAsi Tipo I.
  2. Tritare bene il tessuto con un 15 ° lama chirurgica sterile n.
  3. Transfer il tessuto dalla piastra ad una provetta ml conica 15.
  4. Lavare le cellule del tessuto / restano sulla piastra con 1 ml di PBS + 2% FCS e trasferimento alla stessa provetta.
  5. Incubare in un agitatore incubatore per 20 minuti a 37 ° C, 200 rpm (raccomandazione: preriscaldare l'incubatrice).
  6. Aggiungere 20 ml di EDTA 0,5 M e incubare per altri 10 min a 37 ° C, 200 rpm.
  7. Riempire la provetta fino a 12 ml con PBS + 2% FCS e centrifugare a 4 ° C, 400 x g per 8 minuti (si consiglia di pre-raffreddamento della centrifuga).
  8. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere con 2 ml di PBS + 2% FCS.
  9. Filtrare il campione con un 70 micron cella-filtro e salvare il flusso attraverso.
  10. Centrifugare a 4 ° C, 320 xg per 5 min.
  11. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere con 300 microlitri di PBS + 2% FCS.
  12. Contare le cellule (circa 5-10 x 10 5 cellule sono attesi da un singolo mascellare).

3. Anticorpo extracellulare e intracellulareLa colorazione per Citometria a Flusso Analisi

Si consiglia di lavorare all'interno di una cappa, con le luci spente. È fondamentale per mantenere le cellule in ambiente freddo costante, così come tutti i materiali necessari.

  1. Colorare le cellule contro molecole extracellulari aggiungendo 0,2-0,5 ug di ciascun anticorpo selezionata per 1 x 10 6 cellule in un volume totale di 100 microlitri.
  2. Vortex brevemente.
  3. Incubare le provette per 15 minuti al buio a 4 ° C.
  4. Lavare le cellule con 2 ml di PBS + 2% FCS.
  5. Centrifugare a 4 ° C, 320 xg per 5 min.
  6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo, goccia a goccia, 500 microlitri freddo BD Cytoperm / Cytofix mentre vortex.
  7. Incubare le provette per 40 min a 4 ° C al buio.
  8. Vortex brevemente.
  9. Lavare le cellule due volte con 1 ml di freddo BD Perm / tampone di lavaggio e centrifuga a 800 xg per 7 minuti a 4 ° C.
  10. Aspirare il surnatante eccetto 300 microlitri.
  11. Colorare le cellule intracellulare dallaaggiungendo 1 ug di ciascun anticorpo selezionata per 1 x 10 6 cellule in un volume totale di 100 microlitri.
  12. Vortex brevemente.
  13. Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C.
  14. Lavare le cellule due volte con 1 ml di freddo BD Perm / tampone di lavaggio e centrifuga a 800 xg per 7 minuti a 4 ° C.
  15. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con l'aggiunta di 300 ml freddo BD Perm / Wash Buffer.
  16. Vortex brevemente.
  17. Trasferire la sospensione, mentre il filtraggio di tubi FACS.
  18. Tenere i tubi in un ambiente buio e fredda fino all'analisi.

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Risultati

Esempi di analisi di citometria a flusso su cellule gengivali sono presentati. Cellule gengivali pool da 2 topi sono stati eseguiti in un LSR II citofluorimetro e analizzati utilizzando il software FlowJo. Figura 3A dimostrato la distribuzione delle cellule gengivali da topi naive in un side scatter (SSC) rispetto forward scatter (FSC) trama. Strategia di gating per identificare (i) linfociti (ii) monociti / cellule dendritiche e (iii) granulociti è indicata. Fini confronto, presentiamo anche una trama ...

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Discussione

Maxilla tessuti gengivali ottenuti da un singolo mouse sono sufficienti per analizzare sottopopolazioni di linfociti T e B, così come la loro capacità di esprimere molecole extracellulari ed intracellulari come noi descritta 1. Tuttavia, se le popolazioni di cellule rare sono di interesse (ad esempio DC), si raccomanda di tessuti piscina 2-3 topi. Di nota, se preferibile, è possibile sbucciare entrambi i tessuti palatali e gengivale e quindi di asportare la gengiva (una modifica del passo 1.8-1.9). Va ricorda...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal Israel Science Foundation (n. 1418/11) per AHH e (n. 1933/12) a AW, la Fondazione israeliana tedesco per i giovani ricercatori (GIF Young) di AHH, e la dottoressa mi . Cabakoff Research Fondo di dotazione presso la University-Hadassah School of Dental Medicine di AHH e AW ebraico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi di tipo IIWorthington Biochemical Corp.CLS-2
DNAsi ISIGMADN25-1G
EDTASIGMAE6758-100G
Dulbecco's PBSSIGMAD8537
Siero fetale bovino Biological Industries04-121-1Filtro sottovuoto inattivato a caldo
Jet BiofilFPE-204-500
5 ml Polistirene a fondo tondo TuboBD Falcon352052
Filtro cellulare 70 μ mSPL Lifesciences93070
Piatto per coltura tissutale 35× 10 mmNUNC153066
BD Cytofix/CytopermBD554714
Anti-topo CD11c anticorpoBiolegend117305Clone N418
Anti-topo CD45.2 anticorpoBiolegend109819Clone 104
Anti-topo CD4 AnticorpoBiolegend100413Clone GK1.5
Anti-topo CD8a anticorpoBiolegend100733Clone 53-6.7
Anti-topo CD3 anticorpoBiolegend100214Clone 17A2
Anti-topo CD326 (Ep-CAM) anticorpoBiolegend118219Clone G8.8
Anti-topo CD207 (Langerin)ImgenexDDX0362DClone 929F3.01
Anti-topo I-Ad (MHC-II) anticorpoBiolegend115010Clone 39-10-8
Citometro a flusso LSR IIBD Biosciences
FlowJo Software v 7.6.5Tree Star

Riferimenti

  1. Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
  2. Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
  3. Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
  4. Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
  5. Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
  6. Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
  7. Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
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  9. Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
  10. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).

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