Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

Sommario

Procedure su micropiastra sono descritte per l'analisi colorimetrica o fluorimetrica dell'attività enzimatica extracellulare. Tali procedure consentono la rapida saggio di tale attività in un gran numero di campioni ambientali in tempi gestibile.

Abstract

Gran parte del ciclo dei nutrienti e lavorazione del carbonio in ambienti naturali avviene attraverso l'attività degli enzimi extracellulari rilasciati da microrganismi. Così, misurazione dell'attività di questi enzimi extracellulari può dare intuizioni aliquote di processi livello dell'ecosistema, quali la decomposizione della materia organica o azoto e fosforo mineralizzazione. I saggi di attività enzimatica extracellulare nei campioni ambientali tipicamente coinvolgono esponendo i campioni a substrati colorimetrici o fluorimetrici artificiali e il monitoraggio del tasso di idrolisi del substrato. Qui si descrivono i metodi su micropiastra per queste procedure che consentano l'analisi di un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo. I campioni vengono lasciati reagire con substrati artificiali entro 96 pozzetti o pozzo profondo blocchi micropiastre, e l'attività enzimatica viene successivamente determinati mediante assorbimento o fluorescenza del prodotto finale risultante utilizzando un tipico Reade micropiastrar o fluorimetro. Tali procedure ad alto rendimento facilitare non solo i confronti tra siti o ecosistemi spazialmente separati, ma anche di ridurre sostanzialmente il costo di tali dosaggi, riducendo i volumi complessivi dei reagenti necessari per campione.

Introduzione

Microrganismi come batteri e funghi ottengono nutrienti e il carbonio di composti organici complessi attraverso la produzione di enzimi extracellulari. Questi enzimi idrolizzano tipicamente polimeri in subunità più piccole che possono essere presi in cella. Pertanto, a livello ecologico, questi enzimi extracellulari microbici sono responsabili di gran parte della mineralizzazione dei nutrienti e la decomposizione della materia organica che si verifica in ambienti naturali. Enzimi come cellobioidrolasi (CBH) e β-glucosidasi sono importanti per la degradazione della cellulosa e lavorare all'unisono per catalizzare l'idrolisi di cellulosa in glucosio ^1,2,

Protocollo

L'analisi colorimetrica di extracellulare Enzyme Activity in terreni e sedimenti

1. Preparazione del substrato e Soluzioni tampone per analisi colorimetriche di Enzyme Activity

1. Preparare H 50 mM tampone acetato (pH 5,0-5,5) mescolando 50 ml di 0,1 M di acido acetico (2,87 ml di acido acetico glaciale in 500 ml di acqua), 150 ml di acetato di sodio 0,1 M, e 200 ml di acqua distillata ₂ O. Regolare il pH a 5,0-5,5 con 0.1 M di acido acetico, se necessario.
2. Preparare una soluzione di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) in H ₂ O distillata O.
3. Preparare le soluzioni di substrato NP-linked ....

Risultati

Suoli e sedimenti acquatici in genere hanno apprezzabili livelli di attività enzimatica extracellulare come risultato di comunità microbiche allegate (biofilm) cresce sulla superficie delle particelle. Figura 3 mostra come questa attività cambia a seconda delle dimensioni delle particelle ottenute dal sedimento superficie di un terzo Flusso ordine nel nord del Mississippi, USA. Un precedente studio ha dimostrato che le comunità batteriche sulle particelle di sedimenti da questo flusso possono essere sud.......

Discussione

Determinazione delle attività di una varietà di enzimi extracellulari microbiche in suoli e sedimenti può fornire indicazioni utili in tassi di mineralizzazione dei nutrienti e trasformazione di materia organica ^17. Tuttavia, i suoli possono variare nei loro livelli di umidità, quindi è importante standardizzare l'attività di suolo peso secco. Ciò richiede una fase di asciugatura addizionale (tipicamente di due giorni) oltre la semplice misurazione dell'attività enzimatica. Pertanto, a differenza di s.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTI E MATERIALI
Acido			Fornitori vari Acetato
		sodio	Fornitori vari
Idrossido			Fornitori vari
p-Nitrofenolo	Fisher	BP612-1	Alternative disponibili
p-Nitrofenile (pNP)-fosfato	Sigma	N3234	pNP-substrato
pNP-β-glucopiranoside	Sigma	N7006	pNP-substrato
pNP-β-N-acetilglucosaminide	Sigma	N9376	p Substrato NP
Micropiastre trasparenti a 96 pozzetti	Fisher	12-563-301	Alternative disponibili
Blocchi di pozzetti profondi a 96 pozzetti	Costar	3958	Alternative disponibili
Piatti di			Fornitori vari
Provette			Fornitori vari
Provette			da centrifuga sterili da 50 mlFornitori vari
4-Metilumbelliferone	Sigma	M1381
4-Metilumbelliferil (MUB)-fosfato	Sigma	M8883	substrato MUB
4-MUB-glucopiranoside	Sigma	M3633	substrato MUB
4-MUB-N-acetilglucosaminide	Sigma	M2133	substrato MUB
Bicarbonato			Fornitori vari
Micropiastra nera a 96 pozzetti	Costar	3792
		per pipette	Fornitori
EQUIPMENT
Centrifuga	Eppendorf	5810R
Rotore per centrifuga	Eppendorf	A-4-81	Per micropiastre/blocchi
a pozzetti profondiLettore di micropiastre	BioTek	Synergy HT	Alternative disponibili Fluorimetro
per micropiastre	BioTek	FLx 800	Alternative disponibili
Pipettatore			Vari fornitori

acetico glaciale di di sodio pesata in alluminio da centrifuga sterili da 15 ml di sodioSerbatoio vari a 8 canali