Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

Protesi retiniche potrebbero presto diventare interventi clinici utili per il trattamento di varie forme di grave perdita della vista. Alcune condizioni, come la retinite pigmentosa (RP), danno come risultato la diffusa degenerazione dei fotorecettori negli occhi, queste sono le cellule responsabili della trasduzione di luce in segnali neurali. Tuttavia, alcune cellule in altri strati della retina rimangono e sono potenziali bersagli per la stimolazione elettrica con una protesi retinica ^1. I primi risultati di studi clinici sono stati promettenti per schiere di elettrodi impiantati nel epiretinal ^{2,3, 4,5,} e sottoretinico intrasclerale ⁶ posizioni. Questi dispositivi sono realizzati con materiali differenti con differenti forme, ma tutti usano impulsi elettrici per attivare i restanti neuroni vitali della retina in modo da creare percetti visivi.

Il nostro gruppo più ampio (Bionic Vision Australia) ha sviluppato un impianto retinico che ha progressed ad uno studio clinico pilota con 3 pazienti RP impiantati con schiere di elettrodi sovracoroideale (Clinical Trial Numero: NCT01603576). figura 1A mostra questo prototipo sovracoroideale protesi retinica.

La sicurezza del paziente è fondamentale in studi clinici e quindi, prima di iniziare la sperimentazione umana, abbiamo effettuato numerosi test acuto e cronico in modelli preclinici (Figura 1B). Valutazioni istopatologiche erano indispensabili per raffinare le procedure chirurgiche, scorrere progettazione elettrodo, e infine stabilire la sicurezza dell'impianto. Per mantenere un flusso di lavoro efficiente combaciava con le pratiche patologia cliniche standard, una tecnica di embedding di paraffina è stato impiegato. Era anche desiderabile utilizzare procedure di colorazione comparabili con gli standard clinici, come ematossilina ed eosina (H & E), che sono prontamente interpretata dai patologi. Volevamo anche una tecnica che potrebbe essere adattato per le analisi immunoistochimica, inPer facilitare ulteriormente la valutazione cellulare dei tessuti.

La biocompatibilità dei materiali da impianto e la sicurezza della stimolazione elettrica cronica, devono essere attentamente valutati. È importante essere in grado di esaminare l'istopatologia del tessuto oculare adiacente ai singoli elettrodi stimolanti nell'array. Tuttavia, le matrici dovevano essere rimosso prima di trattamento dei campioni in modo che possano essere testati, e perché i loro componenti metallici non potevano essere prontamente sezionato. Di conseguenza, la nostra preparazione tissutale consolidata non permetteva la localizzazione e la mappatura del tessuto rispetto agli elettrodi impiantati ^7. Oltre alla mancanza di un metodo di localizzazione del tessuto, la fissazione con formaldeide standard a base e tecniche di elaborazione provocato artefatti diffuse e distacco della retina dovuto al ritiro differenziale dei vari strati dell'occhio (Figura 2). Dovuto alla non omogeneità di tegli retina, era difficile fare confronti validi con tessuto di controllo, in particolare per le misure quantitative. Queste limitazioni combinati complicate valutazioni accurate del potenziale danno causato dai nostri array impiantati.

Qui vi presentiamo nuove tecniche per superare queste limitazioni. Abbiamo modificato le tecniche specializzate di fissaggio e l'elaborazione degli occhi ^8-10 per mantenere la compatibilità con istologia a base di paraffina. Abbiamo modificato le macchie istologiche e immunoistochimiche standard per dare risultati comparabili, in base al feedback da patologi clinici. Dopo il rendering il traslucido tessuto sclerale, un codice-colore dye stato impiegato per marcare il tessuto oculare adiacente a ciascun singolo elettrodo, prima di rimuovere la matrice dallo spazio sovracoroideale. Marcando la matrice di elettrodi e dei singoli siti di elettrodi, i campioni possono essere raccolti con precisione da elettrodi regioni adiacenti. Campioni appaiati potrebbero essere raccolti da thocchio di controllo e al fine di facilitare i confronti a coppie.

1. Enucleazione e post-fissazione

Questo protocollo presuppone che il soggetto è stato impiantato unilateralmente con una matrice di elettrodi sovracoroideale.

1. Preparare le soluzioni di postfix in vetro Schott bottiglie.
   1. Soluzione fissativa di Davidson, 2x 100 ml
      • 2 ml di formalina (37% di formaldeide)
      • 10 ml di acido acetico glaciale (99,7%)
      • 35 ml di etanolo (98%)
      • 53 ml di acqua distillata
   2. 50% di etanolo, 2x 100 ml
   3. 70% di etanolo, 2x 100 ml
2. Perfusione transcardiaca soggetto con caldo (37 ° C) soluzione fisiologica eparinizzata seguita da freddo (4 ° C) formalina tamponata neutra (10%).
3. Legare suture al limbus superiore (o una posizione che è remota dalla matrice sovracoroideale) di entrambi gli occhi - in linea con un muscolo retto, per servire come punto di riferimento.
4. Occhi enucleare, mantenendo qualche pista esterni dall'occhio impiantato.
5. Posizionare each occhio in 100 ml di soluzione fissativa di Davidson e lasciare al post-fissare a temperatura ambiente.
6. Dopo 18 - 36 h in fissativo di Davidson, trasferimento in etanolo al 50% (temperatura ambiente) per 6-8 ore, poi finalmente al 70% di etanolo (temperatura ambiente).
7. Refrigerare i campioni a 4 ° C e conservare fino dissezione.

Intatto e pressurizzata globi oculari sono stati memorizzati in questo modo per un massimo di 3 mesi senza danni per l'istologia risultante.

2. Identificazione e mappatura del tessuto

Il protocollo di fissaggio sopra (fase 1) ha reso la sclera traslucida e l'array è ora visibile - compresi i singoli siti elettrodi (Figura 3).

1. Rimuovere il mondo impiantato da etanolo e con attenzione tagliare via il tessuto in eccesso, compresi congiuntiva e della capsula di Tenone. Trim nervo ottico a un 2 - 3 mm di lunghezza (Figura 3A).
2. Utilizzando un colorante istologico Marking schema, etichetta gli elettrodi con un codice colore predefinito, facendo attenzione a non sporcare il colorante.

• Abbiamo scelto una suite disponibile in commercio specializzato di colorante istologico (vedi appendice). Piccole quantità di colorante sono stati accuratamente applicati con un pennello a punta fine (dimensione Roymac 00) per il tessuto e lasciati asciugare all'aria per un massimo di 5 min.
• Per i nostri scopi, abbiamo scelto: verde per l'elettrodo attivo (s), che era (erano) stimolato al massimo, a livelli suprathreshold, per la durata dello studio, rosso per altri elettrodi attivi; giallo per i più grandi elettrodi di ritorno di diametro, e blu per ulteriori guide e / o marcature distanze anatomiche (figure 3B e 3C).
• Alcuni tentativi ed errori possono essere tenuti a trovare un colorante che è stabile in tutte le fasi successive. Ad esempio, in Figura 4, si può vedere che il colorante verde era più resistente rispetto al colorante rosso. Diluendo il colorante in etanolo al 70% contribuisce a migliorare Penet lipidicorazione e rivestimento dei tessuti.
• E 'utile per disegnare o fotografare il mondo tinto per riferimento futuro.

3. Ritorna al 70% di etanolo per disidratare il colorante.
4. Ripetere il punto 2.1 per il globo controllo non impiantato.
5. Utilizzando i punti di sutura dal punto 1.3, allineare l'occhio di controllo e l'occhio impiantato come una coppia di mirroring.
6. Inserire un modello di silicone (con le stesse dimensioni della matrice di elettrodi) nella posizione speculare sull'occhio controllo come l'impianto si trova su occhio impiantato (NB sclera traslucido e le marcature a tintura passo 2,2 permettere la visualizzazione della posizione pronta matrice impiantato ).
7. Eseguire i passi 2.2 e 2.3 per l'occhio di controllo, in modo che ogni sito elettrodo impiantato ha una coppia di controllo in una posizione anatomicamente comparabile (quali specchio abbinato equivalente).

3. Dissezione e Embedding

1. Rimuovere l'array impianto dall'occhio e rimuovere la parte anteriore dell'occhio(Compresa la cornea, l'iride e la lente). Rimuovere il fluido vitreo dalla coppa occhio rimanente (camera posteriore).
2. Sezionare l'occhio impiantato in più strisce rappresentativi (~ spessore 2 mm) ciascuno contenente un sottoinsieme delle regioni contrassegnati colorante (Figura 3D). Notare che l'orientamento delle strisce dovrebbe essere selezionato per assistere nella valutazione vari aspetti della risposta dei tessuti all'impianto ^7.

E 'utile, per il futuro, per fare una registrazione di quali regioni coloranti sono presenti su ogni striscia e le loro posizioni relative (e colori).

3. Posizionare la striscia su un lato in un pool di agar liquefatto (4%, 80 - 90 ° C) con il lato da tagliare prima rivolto verso il basso (Figura 3E).
4. Una volta che l'agar ha fatto presa, tagliare intorno al campione e posto in una cassetta tessuto sostenuto da inserti in schiuma (Figura 3F).
5. Ripetere i passaggi 3,1-3,3 per l'occhio di controllo - taking cura di sezionare a specchio abbinati strisce.
6. Elaborare tutte le cassette tramite tecnica di lavorazione di paraffina standard (automatico durante la notte).
7. Incorpora tessuti trattati in paraffina con il lato da tagliare prima rivolta verso il basso.

4. Taglio e colorazione

1. Tagliare i blocchi di paraffina in 5 sezioni micron riferiscono regolarmente alle note da passaggi 2 e 3.
2. Raccogliere sezioni da ciascuna delle regioni tinti e montare su slitte.

La regione immediatamente adiacente ad ogni spot tinti di sclera può essere ora valutata con fiducia che era in prossimità più vicina al corrispondente elettrodo nella matrice (Figura 4).

3. Macchia o eseguire immunofluorescenza, se lo desideri. Macchie di esempio e di immunoistochimica illustrati nella Figura 5 sono: H &E; Luxol veloce blu (LFB), violetto cresolo; azzurro tricromica di Masson; acido periodico di Schiff (PAS); Perls 'blu di Prussia stain; anti-glutammina sintetasi (GS), proteina anti-neurofilamenti (NF); anti-proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
4. Macchie standard e speciali sono stati eseguiti come specificato:
   1. Colorazione H & E è stata eseguita secondo il protocollo fornito da Leica Multistainer bagno serie ST5020 (Leica Biosystems).
   2. Violetto LFB e cresyl (modificato da ^11):
      1. Sparaffinatura in 3 cambi di xilene (3x 2 min) e 2 cambi di etanolo (100%, 100%) (2x 1 min) e sciacquare con acqua di rubinetto (45 sec).
      2. Sezioni idrato al 95% di etanolo.
      3. Luogo in soluzione LFB ¹¹ a 37 - 42 ° C (durante la notte).
      4. Risciacquare macchia in eccesso con il 70% di etanolo.
      5. Lavare in acqua distillata.
      6. Posto in carbonato di litio diluito (8%) (alcuni secondi).
      7. Differenziare in 70% di etanolo (alcuni secondi).
      8. Lavare in acqua distillata.
      9. Ripetere i punti 4.4.2.6 a 4.4.2.8, se necessario, fino a quando background è incolore.
      10. Posto in soluzione di acetato violetto cresolo lavora a 37 ° C (10 min).
      11. Non lavare in acqua.
      12. Disidratare in 3 cambi di alcol assoluto (1x 30 sec, 2x 20 sec) e 3 cambi di xilene (1x 1 min 30 sec, 1 min 2x).
      13. Monte e coprioggetto con DPX.
   3. Di Masson tricromica blu (modificato da ^11):
      1. Sparaffinatura come da 4.4.2.1.
      2. Portare le sezioni all'acqua (2 min).
      3. Colorare i nuclei con Weigert ferro ematossilina (2 min).
      4. Lavare in acqua di rubinetto, lavare in acqua distillata.
      5. Colorare con soluzione di fucsina scarlatto-acido Biebrich (5 min).
      6. Lavare in acqua distillata.
      7. Differenziare in acido fosfomolibdico-fosfotungstico fino collagene è rosa pallido (6 min).
      8. Lavare in acqua distillata.
      9. Di contrasto in blu di anilina (1 min).
      10. Lavare bene in acido acetico 1% (1 min).
      11. Disidratano, montaggio e coprioggetto come per 4.4.2.12 e 4.4.2.13.
   4. PAS (modificato da ^11):
      1. Sparaffinatura come da 4.4.2.1.
      2. Ossida in acido periodico 1% (15 min).
      3. Lavare in acqua distillata acqua poi.
      4. Colorare con reattivo di Schiff (15 min).
      5. Lavare in acqua (5 min).
      6. Di contrasto con ematossilina Harris (1 min).
      7. Lavare rapidamente in acqua corrente.
      8. Differenziare in 0,5% di alcol acido (1 dip).
      9. Lavare bene in acqua di rubinetto.
      10. Blu in acqua di rubinetto di Scott (1 min).
      11. Lavare bene in acqua.
      12. Disidratano, montaggio e coprioggetto secondo 4.4.2.12 e 4.4.2.13.
   5. Perls 'blu di Prussia macchia come descritto in ^11.
5. Immunofluorescenza è stata eseguita come descritto:
   1. Sparaffinatura come da 4.4.2.1.
   2. Lavare in acqua distillata (2x 5 min).
   3. Eseguire recupero dell'antigene utilizzando tampone citrato 0,01%, pH 6 a 75 - 80 ° C (20 min) unad lascia raffreddare in soluzione tampone citrato 0,01% (20 min).
   4. Lavare le sezioni in tampone fosfato (PBS) (2x 5 min).
   5. Permeabilize la membrana cellulare in soluzione tampone di lavaggio (10 min).
   6. Incubare in soluzione di blocco siero (2 ore).
   7. Incubare le sezioni in un unico anticorpo primario diluito in diluente anticorpale (10% normale di capra serum/0.1% Triton X-100/PBS) (durante la notte in frigo). Il titolo di ogni anticorpo primario utilizzato è mostrato nella Tabella 1.
   8. Dopo una notte di incubazione, lavare le sezioni in soluzione tampone di lavaggio (5x 3 min). Da questo punto in poi, tenere sezioni nel buio.
   9. Incubare le sezioni del corrispondente anticorpo secondario a un titolo di 1:500 per una durata specifica (vedi Tabella 1 per i dettagli).
   10. Lavare le sezioni in soluzione tampone di lavaggio (3x 5 min).
   11. Incubare sezioni in DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min).
   12. Lavare le sezioni in soluzione tampone di lavaggio (3x 5 min).
   13. Monte e coprioggetto utilizzando fluorescentimezzi di montaggio NT.

I campioni di prova e di campioni di controllo sono pronti per il confronto a coppie.

La figura 4 mostra una sezione rappresentativa risultante dal taglio del campione illustrato nella Figura 3. La sezione è stata tagliata a 5 micron di spessore e colorate con H & E secondo i protocolli descritti sopra. La forma grave della striscia campione viene conservato con minimi artefatti tissutali differenziali (Figura 4A). Entrambi i marchi tinture erano visibili sulla sclera, anche se il colorante verde era più resistente rispetto al rosso (Figura 4B). Gli strati della retina non erano artifactually staccati e la morfologia della retina è conservato (Figura 4C). Il tessuto retinico adiacente alle marcature di colorante, che corrisponde alla posizione degli elettrodi nella matrice, può essere facilmente identificato.

La figura 5 mostra colorazione speciale rappresentativo e immunoistochimica di sezioni di tessuto preparati secondo il protocollo corrente. Fare riferimento alla Figura 5 caption e integrative Materiali per maggiori dettagli sulle macchie specifiche e le modifiche apportate al loro utilizzo. Post-modifica, queste macchie e immunoistochimica erano equivalenti alle norme stabilite - come verificato dai patologi.

Tipo di anticorpo primario e titolo (in parentesi)	GFAP (1:1500)	NF200 (1:100)	GS (1:100)
Tipo di anticorpo secondario e titolo (in parentesi)	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 488
Durata dell'incubazione di anticorpo secondario	1 ora	2 hr	45 min

Tabella 1. Tipo di anticorpo, Titolo e Durata della etichettatura.

Figura 1. SuprachoroIdal Prototype Electrode Array. A) Macro fotografia di un grado di allineamento stampata clinica. B) Microfotografia di una matrice preclinica a mano.

Figura 2. L'ex Istologia retinica. Metodi istologici standard sono stati usati per preparare questi, H & E macchiato, sezioni di un occhio impiantato con una matrice di elettrodi sovracoroideale. A) Una sezione ortogonale attraverso la cavità matrice di elettrodi (rappresentato da una stella). La retina è staccato dal tessuto oculare esterno. Ciò è particolarmente evidente di sotto della regione impiantata (freccia). È impossibile determinare quale porzione di retina era adiacente ad ogni singolo elettrodo della matrice. Barra di scala = 1 mm. B) Un maggiore ingrandimento della regione inscatolato in Pannello A. Ci sono parecchi, regolarmente distanziate, manufatti in Laye retinars (frecce), così come importanti distacco dallo strato tappetale (lo strato riflettente in occhi felini). Barra di scala = 100 micron. C) Un maggiore ingrandimento della regione inscatolato in pannello B. Freccia indicata i segmenti esterni dei fotorecettori, così come l'epitelio pigmentale, che rimangono intatte, suggerendo che il distacco era artefatta un effetto collaterale del trattamento, invece di essere causato da un trauma in vivo o patologia. Barra di scala = 20 micron.

Figura 3. La localizzazione e la dissezione di elettrodo-Adiacente Tissue. DC) fotografie di alta gamma dinamica di macro di un occhio enucleato, con una matrice di elettrodi sovracoroideale in situ. A) Messaggio fissati con fissativo di Davidson, e prima della rimozione di matrice, la sclera traslucido consente la visualizzazione dii singoli elettrodi della matrice (unico esempio indicato con la freccia). B) Gli elettrodi sono contrassegnati con un colore della tintura predefinito. c) le indicazioni Dye a spaziatura regolare di punti di riferimento anatomici vengono utilizzati per mantenere la coerenza tra gli esperimenti. D) In caso di rimozione del matrice, l'occhio è sezionato a mano in strisce di esempio. Frecce colorate indicano due dei siti adiacenti elettrodi sulla sclera. Giallo linea tratteggiata indica piano di sezionamento. E) Macro-fotografia della striscia campione incorporato all'interno di un blocco di agar. F) Macro fotografia della striscia campione di agar-embed da pannello E, tagliato e messo in un cassetto embedding supportati da cuscinetti in schiuma di biopsia per minimizzare il movimento della sezione durante la lavorazione.

Figura 4. Nuovo Istologia retinica. trong> La striscia campione di cui sopra (da Figura 3D), che contiene la tasca elettrodo, è stato incluso in paraffina, sezionati a 5 micron e colorati con H & E. A) Verde e regioni tinti di rosso (indicato dalle frecce, stessi come figura 3D) sono visibili in una sezione presa al livello della linea tratteggiata gialla in figura 3D. Barra di scala = 1.000 micron. La retina non viene staccato, né sotto la tasca schiera né da remoto. B) La regione in scatola da Pannello di A con visibile colorante rosso e verde indicato dalle frecce, e la retina intatta tutta. Barra di scala = 500 micron. C) la regione in scatola da Pannello di B, che mostra il intatta, attaccato, retina adiacente al colorante verde. Barra di scala = 50 micron. Sapendo che la posizione del colorante indica la posizione di un elettrodo, possiamo tranquillamente valutare il tessuto retinico adiacente per danni eventuali causati dalla stimolazione elettrica.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figura 5. Esempi di cytohistochemistry retina modificata utilizzando colorazioni speciali e di immunofluorescenza. L'uso di fissativo di Davidson, al contrario di tecniche standard di fissaggio in formalina, le modifiche richieste per i protocolli di colorazione usuali, come indicato nel testo del protocollo principale. I patologi hanno confermato che tali modifiche hanno comportato colorazione equivalente. A) H &E; ematossilina macchie cella nuclei viola mentre eosina macchie citoplasma delle cellule, collagene e di supporto del tessuto varie sfumature di rosa. B) LFB mielina macchie blu di contrasto, mentre il violetto cresolo può essere utilizzato per . identificare le cellule gangliari dalla colorazione corpi di Nissl all'interno pericarion blu e mettendo in evidenza le cellule satelliti che circondano le cellule C) tricromica di Masson blu; la ZEMENTWERKE scarlatto-fucsina acida soluzione macchie muscolare fibri rosso, mentre le macchie blu anilina il collagene, in questo caso sclera, blu D) PAS;. componenti glicoproteina di membrana basale e di componenti del tessuto connettivo sono macchiati viola, mentre la ematossilina controcolorazioni cella nuclei viola E) Perls 'blu di Prussia.; alla sede di emorragia, la formazione di emosiderina da cellule rosse del sangue degradati e liberazione del complessi del ferro produce un colore viola mentre l'aggiunta di colori rosso macchia rossa neutri lisosomi F) GS,. questo neurotrasmettitore enzima degradante trova nelle cellule Müller 13 (verde ), può essere visto estende in entrambe le direzioni con i corpi cellulari Müller nello strato nucleare interno e endfeet cella Müller formando il G membrana limitante interna) NF-200;. questa catena pesante proteina del citoscheletro (verde) trovata nel soma e processi cellulari , legami crociati con altre neurofilaments per mantenere la struttura dei neuroni 14,15. Gangliocellule ei loro assoni possono essere visti nello strato delle cellule gangliari e strato delle fibre nervose, mentre assoni delle cellule orizzontali poste al confine esterno dello strato nucleare interno nella retina felina, sono anche evidenziati. Colorazione di contrasto con DAPI (blu) permette la visualizzazione di strati retinici H) GFAP;. Questa proteina del citoscheletro (rosso) proliferato in cellule di Muller e astrociti durante gliosi 16, può essere visto in fila strato delle fibre nervose con le cellule Müller formando estensioni sottili attraverso l'interno di strati retinici esterni. Controcolorazione con DAPI (blu) permette la visualizzazione degli strati retinici. Barra di scala = 50 micron di tutti i pannelli. La retina interna è mostrato nella parte superiore di ogni immagine, la retina esterna viene mostrato nella parte inferiore di ciascuna immagine, escludendo Panel E, che mostra la reazione subscleral.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.