Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Milena Z. Adzemovic; Manuel Zeitelhofer; Marianne Leisser; Ulricke Köck; Angela Kury; Tomas Olsson

doi:10.3791/50425

Articolo metodologico

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

DOI:

10.3791/50425

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14 novembre 2016

Milena Z. Adzemovic¹^,² , Manuel Zeitelhofer¹^,³ , Marianne Leisser² , Ulricke Köck² , Angela Kury² , Tomas Olsson¹

¹Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, ²Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, ³Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo qui un protocollo ottimizzato e dettagliato per la doppia immunocolorazione in sezioni di tessuto del sistema nervoso centrale (SNC) e dei linfonodi periferici (LN) di ratto fissate in formalina e incluse in paraffina.

Abstract

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Immunoistochimica (IHC) prevede la visualizzazione di proteine altamente specifiche, affidabile e attraente. corretta esecuzione e interpretazione di un etichette multicolori IHC-based è impegnativo, soprattutto se utilizzata per valutare interrelazioni tra proteine bersaglio nel tessuto con un alto contenuto di grassi come il sistema nervoso centrale (CNS).

Il nostro protocollo rappresenta un perfezionamento della tecnica immunomarcatura serie particolarmente adeguato per il rilevamento di entrambe le proteine strutturali e solubili nel ratto SNC e linfonodi periferici (LN) affetti da neuroinflammation. Tuttavia, con o senza ulteriori modifiche, il nostro protocollo potrebbe probabilmente essere utilizzato per il rilevamento di altri bersagli proteici correlati, anche in altri organi e specie che qui presentato.

Introduzione

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Nonostante l'utilizzo di tecnologie avanzate high-throughput analisi effettuate sul methylome, trascrittoma o addirittura a livello del proteoma, immunostaining rimane il golden standard per la rilevazione delle proteine direttamente nel campione di tessuto, coltura cellulare o uno striscio di cellule. Rivelando il modello di localizzazione / distribuzione, immunoistochimica (IHC) può valutare i rapporti relativi e interrelazioni topografiche delle proteine bersaglio, e anche indicare le loro attività biologiche. Pertanto, IHC è ampiamente utilizzata per scopi clinici e di ricerca, per esempio, per la diagnosi, valutazioni di trattamento, lo studio d....

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Protocollo

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Dichiarazione etica
presente studio è effettuata in conformità con le linee guida del Consiglio nazionale svedese per gli animali da laboratorio e la direttiva della Comunità europea (86/609 / CEE) sotto i permessi etici N338 / 09, N15 / 10 e N65 / 10, che sono stati approvati dal Comitato del Nord Stoccolma Animal Ethics.

1. Preparazione del tessuto

Perfusion & fissazione
1. Anestetizzare l'animale con isoflurano per eseguire perfusione transcardial via ventricolo sinistro. Avviare il risciacquo della vascolarizzazione con tampone fosfato (PBS) per rimuovere i componenti del s....

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Risultati

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immunostainings doppie (co-colorazioni) sono stati eseguiti in fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto sezioni del sistema nervoso centrale e LN. 3-5 micron di spessore fette di tessuto sono stati tagliati con un microtomo slitta, montato successivamente su vetrini adesivo pre-verniciato e trattato come descritto in precedenza ^10,11,12. Brevemente, dopo deparaffinizing, reidratazione tessuti e endogena inattivazione perossidasi, sezioni sono stati sottoposti al proces.......

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Discussione

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procedure IHC standard spesso richiedono adattamenti specifici per ottenere un risultato ottimale, che implica comunemente una grande esperienza, ma anche l'approccio "trial and error". Dalla preparazione del tessuto fino visualizzazione di destinazione, quasi ogni fase del protocollo può essere soggetto a modifiche progettate in modo da migliorare il risultato finale. protocollo di doppia colorazione qui presentata esemplifica proteina IHC targeting basato particolarmente adeguato per valutare le interrel.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Hans Lassmann e Jan Bauer per la loro guida e supporto. Ringraziamo anche Katalin Benedek per l'eccellente assistenza tecnica e Caroline Westerlund per la valutazione critica e linguistica.

Questo studio è stato supportato da sovvenzioni di Biogen Idec, della Fondazione Wenner-Gren, del Consiglio svedese delle ricerche, dell'Associazione svedese delle persone con disabilità neurologiche, della Fondazione svedese per il cervello, del 6° quadro europeo EURATools (LSHG-CT-2005-019015) e di Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi d....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C₃H₂ClF₅O)	Baxter	1001936060	Irradiazione oculare. Probabilmente influenza la fertilità e danneggia il bambino nell'utero. Somministrare solo in ambiente anestetizzante adeguatamente attrezzato.
Cloruro di sodio (NaCl)	Merck	1.0604
Soluzione salina tampone fosfato (PBS), compressa	Sigma-Aldrich	P4417
Paraformaldeide [OH(CH₂O)_nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS	Apl pharma	34 24 28	Pericolo per la salute. Corrosivo. Infiammabile. Tossicità acuta.
Etanolo ≥ 99,5%, assoluto (CH₃CH₂OH)	Sigma-Aldrich	459844-1L	Fiammabile.
Xilene (xileni, grado istologico; C₆H₄(CH₃)₂	Sigma-Aldrich	534056	Flamable. Tossicità acuta.
Histo-Comp Paraffin	Wax Tissue-Tek	V0-5-1001
Diapositive adesive per microscopio	Starfrost	MIC-1040-W
Sostituto dello xilolo XEM-200	Vogel GmbH	ND-HS-200	Sensibilizzazione respiratoria. Cancerogenicità.
&alfa;-CD8 (Ox-8) topo anti-ratto, anticorpo primario	AbD Serotec	MCA48G
α-Iba1 (AIF1) topo anti-ratto, anticorpo primario	Millipore	MABN92
α-CD68 (ED1) topo anti-ratto, anticorpo primario	AbD Serotec	MCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) capra anti-ratto, anticorpo primario	Santa Cruz BT	SC-6181
Anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina (AP)	Dakopatts, Danimarca	D0314
Anticorpo secondario biotinilato	Amersham Biotech	RPN1025
Complesso avidina-perossidasi di rafano (HRP)	Sigma-Aldrich	A3151
Naftolo AS-MX fosfato (C₁₉H₁₈NO₅P)	Sigma-Aldrich	N4875-1G	Tossicità acuta.
Sale RR blu veloce, diazo azoico n. 24 (C₁₅H₁₄ClN₃O₃ x 1/2 ZnCl₂)	Sigma-Aldrich	FBS25
Levamisol cloridrato (C₁₁H₁₃ClN_2S)	Sigma-Aldrich	31742	Tossicità acuta.
3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato (Cromogeno DAB)	DAKO	S3000	Facilmente infiammabile. Tossico.
Solfato di rame (CuSO₄)	Merck	1.02791	Tossicità acuta. Pericolo ambientale.
GelTol Mezzo di montaggio acquoso	Thermo Electron Corporation	230100
Perossido di idrogeno, 30% (H₂O₂)	Merck	107210	Tossicità acuta.
Metanolo (CH₃OH)	Fluka	65543	Tossicità acuta. Sensibilizzazione respiratoria. Cancerogenicità. Infiammabile.
Tris (idrossimetil) amminometano, base TRIS (C₄H₁₁NO₃ )	AppliChem	A1379	Irritazione della pelle e degli occhi.
Soluzione salina tamponata Tris (TBS), compressa	Sigma-Aldrich	T5030
Di- Sodio idrogeno fosfato diidrato (Na₂HPO₄ x 2H₂O)	Merck	1.0658
Sodio diidrogeno fosfato monoidrato (NaH₂PO₄ x 1H₂O)	Merck	1.06346
Siero fetale di vitello (FCS)	Cambrex BioScience	DE-14-802F
Tampone di lavaggio per citomazione DAKO 10x	DAKO	S3006	Deve essere conservato a 2-8 gradi; C per inibire la crescita batterica. Evitare la formazione di schiuma.
N,N-dimetilformammide; DMF (C₃H₇NO)	Fluka	40250	Infiammabile. Tossicità acuta.
Vetrini coprioggetti 24 x 36 mm	Menzel-Glä ser	BB024036A1
Acido cloridrico, conc. (HCl)	Sigma-Aldrich	30721	Corrosivo, irritante, permeatore. Sensibilizzante polmonare (come nebbia acida). Tossico.
Soluzione di acido cloridrico volumetrica, 2 M HCl (2 N)	Fluka	71826	Corrosivo, irritante, permeatore. Sensibilizzante polmonare (come nebbia acida). Tossico.
Nitrito di sodio, ReagentPlus, ≥ 99,0% (NaNO₂)	Sigma-Aldrich	S2252	ossidante. Tossico. Pericoloso per l'ambiente.
Sale disodico dibasico dell'acido etilendinitrilotetraacetico (EDTA; C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈ x 2H₂O)	Merck	1.08454	Le esposizioni orali possono causare effetti sulla riproduzione e sullo sviluppo.
Equipment
Tissue-Tek^V.I.P Vacuum Infiltration Processor	Sakura	5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome	Hacker instruments
Vaporiera per alimenti domestici	Braun	MultiGourmet FS 20
Microscopio ottico	Leica Polyvar 2

Riferimenti

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Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
Nakane, P. K., Pierce, G. B.

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Immunoistochimica Preparazione dei tessuti Recupero dell antigene Microscopia ottica Inclusione in paraffina Linfonodi periferici Anticorpi primari Anticorpi secondari Avidina perossidasi di rafano

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