Presentiamo qui un protocollo ottimizzato e dettagliato per la doppia immunocolorazione in sezioni di tessuto del sistema nervoso centrale (SNC) e dei linfonodi periferici (LN) di ratto fissate in formalina e incluse in paraffina.
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Articolo metodologico
Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Immunoistochimica (IHC) prevede la visualizzazione di proteine altamente specifiche, affidabile e attraente. corretta esecuzione e interpretazione di un etichette multicolori IHC-based è impegnativo, soprattutto se utilizzata per valutare interrelazioni tra proteine bersaglio nel tessuto con un alto contenuto di grassi come il sistema nervoso centrale (CNS).
Il nostro protocollo rappresenta un perfezionamento della tecnica immunomarcatura serie particolarmente adeguato per il rilevamento di entrambe le proteine strutturali e solubili nel ratto SNC e linfonodi periferici (LN) affetti da neuroinflammation. Tuttavia, con o senza ulteriori modifiche, il nostro protocollo potrebbe probabilmente essere utilizzato per il rilevamento di altri bersagli proteici correlati, anche in altri organi e specie che qui presentato.
Introduzione
Nonostante l'utilizzo di tecnologie avanzate high-throughput analisi effettuate sul methylome, trascrittoma o addirittura a livello del proteoma, immunostaining rimane il golden standard per la rilevazione delle proteine direttamente nel campione di tessuto, coltura cellulare o uno striscio di cellule. Rivelando il modello di localizzazione / distribuzione, immunoistochimica (IHC) può valutare i rapporti relativi e interrelazioni topografiche delle proteine bersaglio, e anche indicare le loro attività biologiche. Pertanto, IHC è ampiamente utilizzata per scopi clinici e di ricerca, per esempio, per la diagnosi, valutazioni di trattamento, lo studio dei meccanismi della malattia, alterazioni funzionali e fenotipiche in modelli animali, ecc
In sostanza comprende l'istologia, patologia, biochimica e immunologia, IHC è notevolmente avanzato dal 1941, quando gli anticorpi fluorescente sono stati utilizzati per la prima volta ad identificare gli antigeni pneumococco nel tessuto infetto 1. Visualization di prodotti cellulari e componenti per IHC si basa sul legame degli anticorpi (ABS) per la loro specifica antigene (Ag). Oltre a utilizzare fluorofori contrassegnati anticorpi, le reazioni immunitarie possono anche essere visualizzati utilizzando enzimi come la perossidasi 2,3 o fosfatasi alcalina 4. Inoltre, anticorpi oro-tag colloidali 5 sono utilizzati per rilevare specifica interazione antigene-anticorpo sia microscopia ottica ed elettronica, mentre le etichette radioattivi vengono visualizzati mediante autoradiografia.
La reazione immunologica Ag-Ab può essere rilevato tramite metodi diretti e indiretti. Il metodo diretto è sostanzialmente più veloce e più semplice, in quanto utilizza direttamente etichettato Abs primaria 6. Tuttavia, a causa della notevole mancanza di sensibilità, metodi indiretti sono preferiti a quelli diretti. Procedure di rilevamento indiretto due fasi richiedono non marcato Abs primaria, come il primo, ed etichettati Abs secondari diretti contro il Abs primario, come secondo strato 7.amplificazione del segnale può essere ottenuto coinvolgendo ulteriormente, terziaria Ab enzima accoppiato (tre fasi metodo indiretto) che si lega al Ab secondario. metodi di rilevamento indiretto comunemente usati sono avidina-biotina e perossidasi antiperossidasi (PAP). In alternativa, fosfatasi alcalina-antialcalina fosfatasi (APAAP) complesso può essere usato al posto del metodo PAP. In particolare, fosfatasi alcalina (AP) i metodi sembrano essere ancora più sensibile rispetto ai metodi di immunoperossidasi 4. metodo avidina-biotina complesso (ABC) utilizza biotinilato Ab secondario in combinazione con l'etichetta avidina-biotina complesso (LAB), o etichettato streptavidina-biotina complesso (LASTRA). Sensibilità di rilevazione può essere ulteriormente aumentata coinvolgendo avidina marcata con perossidasi o fosfatasi alcalina 8. Altri metodi di rilevamento in uso sono etichettatura polimerico, amplificazione tiramina e immuno-rolling cerchio 9. In particolare, diversi metodi di rilevamento possono essere combinati per la rilevazione multipla Ag nella stessa tessuticampione, che è stato segnalato per la prima volta nel 1978 4. simultanea doppia immunostaining qui presentata è stata eseguita in fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto del sistema nervoso centrale e LN sezioni di tessuto con perossidasi-bound e AP-coniugati anticorpi secondari, rispettivamente. I segnali sono stati visualizzati con 3,3'-diaminobencidine (DAB) cromogeno e il Fast Blue (FB) APAAP complesso, rispettivamente.
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Protocollo
Dichiarazione etica
presente studio è effettuata in conformità con le linee guida del Consiglio nazionale svedese per gli animali da laboratorio e la direttiva della Comunità europea (86/609 / CEE) sotto i permessi etici N338 / 09, N15 / 10 e N65 / 10, che sono stati approvati dal Comitato del Nord Stoccolma Animal Ethics.
1. Preparazione del tessuto
- Perfusion & fissazione
- Anestetizzare l'animale con isoflurano per eseguire perfusione transcardial via ventricolo sinistro. Avviare il risciacquo della vascolarizzazione con tampone fosfato (PBS) per rimuovere i componenti del sangue, seguito da 4% paraformaldeide in PBS 0,1 M (PFA).
- Fissare cervello sezionato, il midollo spinale e dei tessuti periferici LN immergendolo in PFA. Dopo 24 ore a 4 ° C, trasferire il tessuto da PFA in PBS e conservare a 4 ° C fino ad ulteriore lavorazione. In alternativa alla PBS commerciale, dissolvere 9 g di NaCl in 250 ml S &# 246; Rensen tampone e aggiungere 750 ml di acqua deionizzata (DH 2 O); preparare 0,2 M Sörensen tampone (pH 7,4) sciogliere 13,8 g di NaH 2 PO 4 x 1H 2 O e 71,2 g di Na 2 HPO 4 x 2H 2 O in 2,5 L dH 2 O.
- Disidratazione e embedding
- Tagliare il tessuto in porzioni spesse circa 5 mm usando una lama di rasoio.
- Avviare il processo di indurimento tissutale (disidratazione) utilizzando il VIP Vacuum infiltrazione Processor Tissue-Tek (procedura standard basato su sommersione in concentrazioni crescenti di etanolo, seguito da xilene ed infine di paraffina (Tabella 1).
- Posizionare il tessuto in uno stampo e versare il paraffina liquida attorno al campione per formare un "blocco di paraffina". lo stoccaggio a lungo termine richiede temperatura ambiente (RT). Tuttavia, prima di sezionamento, è consigliabile raffreddare i blocchi, ad esempio, durante la notte (o / n) a 4 ° C.
2. Sezioni
- Posizionare il blocco di paraffina in un supporto fisso del microtomo slitta, che può muoversi avanti e indietro attraverso il coltello. Regolare l'angolo ottimale fra la massa e il coltello microtomo (che dipende dalla geometria del coltello, ma anche dalla velocità di taglio e la tecnica).
- Cut 3 - 5 micron di spessore sezioni dal blocco di paraffina.
- Trasferire sezione appena tagliato in un contenitore d'acqua e montate successivamente dall'acqua sul vetrino.
- Premere la sezione montata con cura nei confronti di un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua residua e potenziali bolle d'aria. vetrini adesivi in commercio pre-rivestiti sono raccomandabili.
- Secco diapositive montate per un paio d'ore in una stufa a 50 - 60 ° C.
3. Sparaffinatura (reidratazione e blocco del endogena perossidasi)
- Immergere i vetrini 2x in xilene (sostituto in alternativa xileneXEM-200), ogni volta 15 - 20 '.
- Risciacquare in 99% di etanolo.
- Per bloccare l'attività perossidasica endogena, incubare le sezioni per 30 'in soluzione metanolica contenente perossido di idrogeno 0,25%.
- Continuare reidratazione utilizzando etanolo con l'aumento del contenuto di acqua (99%, 70%, finendo in acqua distillata.
- Da questo punto fino fissaggio del coperchio scivola sezioni devono essere mantenuto umido.
4. Antigen Retrieval
- Utilizzare una vaporiera per bollire i vetrini in una soluzione di antigene recupero (in questo caso EDTA pH 8,5 tampone) per 60 '(EDTA scorta soluzione contiene 1,21 g di Tris e 0,37 g di EDTA sciolti in 50 ml dH 2 O, per preparare il lavoro soluzione diluita 2,5 ml di EDTA soluzione madre in 47,5 ml di dH 2 O).
- Raffreddare i vetrini su RT per ca. 1 ora e poi risciacquare 3 - 5x con Tris Buffered Saline (TBS, utilizzare in alternativa PBS), composto di 0,05 M Tris e 0,15 M NaCl; pH 7,5 regolato with HCl. In alternativa usare TBS commerciale.
5. blocco dei siti legame aspecifico
- Per evitare reazioni aspecifiche sfondo, incubare sezioni di RT per 30 'nella soluzione bloccante contenente 10% di siero fetale bovino (FCS) e 90% di buffer DAKO.
6. Fare doppio immunomarcatura: Incubazione simultanea con gli Abs primari
- Diluire quantità di anticorpi primari nella soluzione di saturazione e incubare o / n a 4 ° C. Per la doppia immunocolorazione combinare α-eotassina (CCL11; 1: 300) con α-CD68 (Ed1; 1: 1.000) o α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) o α-Cd8α (Ox-8; 1: 200) .
- Sciacquare i vetrini 3-5x con tampone TBS (utilizzare in alternativa 10x diluito tampone DAKO).
- Diluire quantità di anticorpi secondari (biotinilato anti-capra e AP-coniugato anti-topo, sia 1: 200) in soluzione di saturazione e incubare 1 ora a RT.
- Sciacquare i vetrini 3 - 5x con tampone TBS (usE In alternativa 10x diluito tampone DAKO).
- Incubare i vetrini con complesso avidina-perossidasi di rafano (HRP) diluita nella soluzione di blocco per 1 ora su RT.
- Sciacquare i vetrini 3 - 5 volte con TBS tampone (utilizzare in alternativa 10x diluito tampone DAKO).
7. Visualizzazione
- Visualizzazione del anticorpo secondario legato AP-marcato
- Preparare 0,1 M Tris-HCl sciogliendo 12,1 g Tris in 1 L dH 2 O e regolare il pH a utilizzando HCl. Utilizzare lo stesso tampone Tris-HCl per preparare soluzione 1 M levamisolo. Preparare freschi 4% soluzione NaNO 2 in DH 2 O.
- Per ottenere 50 ml del substrato Fast Blue (FB) (volume richiesto per una cuvetta di vetro standard) sciogliere 6,25 mg naftolo-AS-MX-fosfato in 312,5 ml DMF nel tubo di vetro e mescolate in 50 ml di pre-riscaldato (37 ° C) tampone Tris-HCl. Per sciogliere 12,5 mg FB RR sale a 312,5 ml 2 N HCl aggiungere 312,5 ml di precedenza Preparosso 4% soluzione di NaNO 2 e agitare la miscela negli stessi 50 ml di pre-riscaldato tampone Tris-HCl. Agitare delicatamente fino a quando il liquido giallo chiaro e, infine, aggiungere 77 ml di soluzione precedentemente preparata 1 M Levamisolo. Filtrato ottenuto miscela e versare su vetrini posti nella provetta di vetro.
- Avviare l'incubazione a 37 ° C e il controllo dei processi di sviluppo sotto il microscopio luce circa. frequenza di 15 - 30 min. Se girando fuzzy, sostituire la soluzione FB con la miscela fresca.
- Sciacquare i vetrini 3 - 5x con tampone TBS e il trasferimento in seguito in tampone PBS.
- Visualizzazione del anticorpo secondario biotinilato legato
- Preparare DAB / H 2 O 2 soluzione di sviluppo diluendo 1 ml di soluzione madre DAB (25 mg DAB per 1 ml di PBS) in 49 ml di PBS. Aggiungere 16,5 ml H 2 O 2 e filtrato prima versando sul sezioni.
- La conversione del cromogeno DAB in fronte precipitaren pigmento può essere immediata. Controllare il processo di sviluppo sotto il microscopio ottico (anche paio di secondi di incubazione più lungo può sollevare uno sfondo alto e mascherare il segnale specifico).
- L'intensità del precipitato pigmento marrone può essere alternativamente migliorata mediante incubazione in soluzione costituita da 2% di solfato di rame e 0,9% NaCl per 5 '.
- Sciacquare i vetrini 3 - 5 volte con PBS e infine con dH 2 O, in alternativa, utilizzare l'acqua del rubinetto.
- Montare le diapositive con copertura scivola direttamente dall'acqua utilizzando acquosa mezzo di montaggio GelTol. Evitare la formazione di bolle d'aria.
- Consentire completa asciugatura del mezzo di montaggio, ad esempio, o / n a 4 ° C. Conservare asciugato diapositive su RT.
| 1. | % di etanolo | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | % di etanolo | 60 &# 39; | 40 ° C |
| 3. | % di etanolo | 90 ' | 40 ° C |
| 4. | % di etanolo | 60 ' | 40 ° C |
| 5. | % di etanolo | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | % di etanolo | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | % di etanolo | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | % di etanolo | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | xylol | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | xylol | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | Paraffina | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | Paraffina | 60 ' | 60 ° C |
| 13. | Paraffina | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | Paraffina | 120 ' | 60 ° C |
Tabella 1. Il trattamento dei tessuti da tessuto-Tek VIP vuoto infiltrazione del processore.
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Risultati
immunostainings doppie (co-colorazioni) sono stati eseguiti in fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto sezioni del sistema nervoso centrale e LN. 3-5 micron di spessore fette di tessuto sono stati tagliati con un microtomo slitta, montato successivamente su vetrini adesivo pre-verniciato e trattato come descritto in precedenza 10,11,12. Brevemente, dopo deparaffinizing, reidratazione tessuti e endogena inattivazione perossidasi, sezioni sono stati sottoposti al proces...
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Discussione
procedure IHC standard spesso richiedono adattamenti specifici per ottenere un risultato ottimale, che implica comunemente una grande esperienza, ma anche l'approccio "trial and error". Dalla preparazione del tessuto fino visualizzazione di destinazione, quasi ogni fase del protocollo può essere soggetto a modifiche progettate in modo da migliorare il risultato finale. protocollo di doppia colorazione qui presentata esemplifica proteina IHC targeting basato particolarmente adeguato per valutare le interrel...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Hans Lassmann e Jan Bauer per la loro guida e supporto. Ringraziamo anche Katalin Benedek per l'eccellente assistenza tecnica e Caroline Westerlund per la valutazione critica e linguistica.
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni di Biogen Idec, della Fondazione Wenner-Gren, del Consiglio svedese delle ricerche, dell'Associazione svedese delle persone con disabilità neurologiche, della Fondazione svedese per il cervello, del 6° quadro europeo EURATools (LSHG-CT-2005-019015) e di Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Irradiazione oculare. Probabilmente influenza la fertilità e danneggia il bambino nell'utero. Somministrare solo in ambiente anestetizzante adeguatamente attrezzato. |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS), compressa | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldeide [OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Pericolo per la salute. Corrosivo. Infiammabile. Tossicità acuta. |
| Etanolo ≥ 99,5%, assoluto (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Fiammabile. |
| Xilene (xileni, grado istologico; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Tossicità acuta. |
| Histo-Comp Paraffin | Wax Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Diapositive adesive per microscopio | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Sostituto dello xilolo XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Sensibilizzazione respiratoria. Cancerogenicità. |
| &alfa;-CD8 (Ox-8) topo anti-ratto, anticorpo primario | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) topo anti-ratto, anticorpo primario | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) topo anti-ratto, anticorpo primario | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) capra anti-ratto, anticorpo primario | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina (AP) | Dakopatts, Danimarca | D0314 | |
| Anticorpo secondario biotinilato | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Complesso avidina-perossidasi di rafano (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naftolo AS-MX fosfato (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Tossicità acuta. |
| Sale RR blu veloce, diazo azoico n. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol cloridrato (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Tossicità acuta. |
| 3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato (Cromogeno DAB) | DAKO | S3000 | Facilmente infiammabile. Tossico. |
| Solfato di rame (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Tossicità acuta. Pericolo ambientale. |
| GelTol Mezzo di montaggio acquoso | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Perossido di idrogeno, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Tossicità acuta. |
| Metanolo (CH3OH) | Fluka | 65543 | Tossicità acuta. Sensibilizzazione respiratoria. Cancerogenicità. Infiammabile. |
| Tris (idrossimetil) amminometano, base TRIS (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Irritazione della pelle e degli occhi. |
| Soluzione salina tamponata Tris (TBS), compressa | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodio idrogeno fosfato diidrato (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodio diidrogeno fosfato monoidrato (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| Tampone di lavaggio per citomazione DAKO 10x | DAKO | S3006 | Deve essere conservato a 2-8 gradi; C per inibire la crescita batterica. Evitare la formazione di schiuma. |
| N,N-dimetilformammide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Infiammabile. Tossicità acuta. |
| Vetrini coprioggetti 24 x 36 mm | Menzel-Glä ser | BB024036A1 | |
| Acido cloridrico, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosivo, irritante, permeatore. Sensibilizzante polmonare (come nebbia acida). Tossico. |
| Soluzione di acido cloridrico volumetrica, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosivo, irritante, permeatore. Sensibilizzante polmonare (come nebbia acida). Tossico. |
| Nitrito di sodio, ReagentPlus, ≥ 99,0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | ossidante. Tossico. Pericoloso per l'ambiente. |
| Sale disodico dibasico dell'acido etilendinitrilotetraacetico (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Le esposizioni orali possono causare effetti sulla riproduzione e sullo sviluppo. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Vaporiera per alimenti domestici | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Microscopio ottico | Leica Polyvar 2 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
