Articolo metodologico
Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.
Al fine di indagare gli eventi di guida lo sviluppo del cuore e per determinare i meccanismi molecolari responsabili delle malattie del miocardio negli esseri umani, è essenziale prima di generare cardiomiociti umani funzionali (CMS). L'uso di queste cellule in scoperta di farmaci e studi tossicologici sarebbe anche molto vantaggioso, permettendo nuove molecole farmacologici per il trattamento dei disturbi cardiaci essere convalidate preclinicamente su cellule di origine umana. Delle possibili fonti di CMS, staminali pluripotenti (iPS) indotte sono tra i più promettenti, in quanto possono essere ricavati direttamente dal tessuto del paziente prontamente accessibile e possiedono una intrinseca capacità di dare origine a tutti i tipi di cellule del corpo 1. Sono stati proposti diversi metodi per differenziare le cellule iPS in CMS, che vanno dai corpi embrionali classiche (EBS) approccio aggregazione chimica definita protocolli 2,3. In questo articolo vi proponiamo un protocollo EB-based e mostriamo come questa metodologiad può essere impiegato per generare in modo efficiente le cellule CM-come funzionali di cellule iPS alimentatore-Free.
Storicamente, l'indagine dei meccanismi genetici e molecolari che guida lo sviluppo umano e la malattia si è basata sulla generazione di modelli animali geneticamente modificati. Tuttavia, numerosi fenotipi umani non riescono ad essere replicato correttamente nei topi, soprattutto a causa delle differenze biologiche esistenti tra le due specie. D'altra parte, l'accesso ai tessuti umani può essere limitata e spesso non permettono abbastanza materiale da ottenere per studi sperimentali approfonditi. Il campo della biologia cardiovascolare soffre di entrambe queste limitazioni: la fisiologia del cuore umano è significativamente diversa da quella del topo, e ....
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1. Manutenzione alimentatore-Free e Passaging delle iPS umane Cell Lines
Nota: le concentrazioni di magazzino Matrigel variano a seconda del lotto. Istruzioni per la diluizione sono indicati sulla sc....
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Nei nostri studi abbiamo generato CM da diverse linee di cellule iPS. Queste linee sono state inizialmente generate su uno strato di alimentatore MEF ma sono stati immediatamente immessi sul Matrigel usando un terreno specifico (sia mTESR1 o Nutristem). Vari metodi sono stati utilizzati per verificare mantenimento delle proprietà morfologiche, l'espressione di marcatori tipici di cellule pluripotenti (OCT-4, SSEA4 e TRA1-60) e la loro stabilità genoma (Figura 1).
Induzio.......
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Cellule staminali pluripotenti hanno la potenzialità di differenziarsi spontaneamente in CMS, anche se con bassa efficienza ed elevata variabilità tra le linee. Lo sviluppo di nuovi metodi di induzione è quindi concentrata sul miglioramento dell'efficienza del processo e muoversi verso protocolli più definiti. Tuttavia, la maggior parte di questi nuovi metodi di differenziazione sono piuttosto complessi, che richiedono condizioni elaborate cultura, controllo fine dei tempi e la concentrazione dei reagenti, e il trat.......
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Non ci sono interessi finanziari a divulgare.
BS è stato sostenuto da Università degli Studi di Milano-Bicocca Summer Student Programma di formazione alla ricerca; ricerca è stata sostenuta da fondi del Ministero della Salute italiano e dal Ministero italiano dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca e la Fondazione Humanitas per GC, si ringraziano Michael VG Latronico per criticamente la lettura del manoscritto.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Media e reagenti | |||
| Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | scongelare il flacone da 5 ml a 4 ° C su ghiaccio O/N, aliquotare in provette criogeniche pre-refrigerate su ghiaccio, secondo le istruzioni di diluizione della scheda tecnica e conservare a -20 gradi; C . |
| Fibronectina, da plasma umano, soluzione allo 0,1% | Sigma | F0896-2MG | Concentrazione di lavoro: 5 μ g/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | Concentrazione di lavoro: 5 μ g/cm2 |
| PBS (senza Mg e Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS (con Mg e Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, proteasi neutra, grado II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 a -20 °; C, soluzione di lavoro: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
| Tripsina/EDTA, 0,5% | Sigma | T3924 | |
| Collagenasi tipo 2 | Worthington | 4176 | Diluire a 480 U/ml (es. 1,6 mg/ml) in PBS con Mg e Ca |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Knockout Siero Sostituzione (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Scongelamento a 4 gradi; C, aliquotare e conservare a -20 gradi C |
| F– tal Siero Bovino (origine Sud America) | Invitrogen | 10270-106 | I lotti devono essere testati per il loro potenziale cardiogeno. Scongelare a 4 gradi C, inattivo termicamente a 56 ° C per 30 min, aliquotare e conservare a -20 gradi C |
| PenStrep, penicillina-streptomicina, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 supplemento, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 integratore, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-mercapt– thanol | Invitrogen | 31350-010 | |
| Gelatina, da pelle suina | Sigma | G1890-100G | Fare brodo all'1% in acqua, conservare a -20 °C. Diluire allo 0,1% in PBS e mantenere a 4 ° C |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combina l'integratore 5X con il terreno di base, aliquote e conservare a -20 °C. Non mantenere il mezzo completo a 4 ° C per più di 1 settimana |
| Nutristem hESC XF | Stemgent di Biological Industries | 05-100-1A | Scongelare a 4 gradi C O/N, aliquotare e conservare a -20 gradi C fino all'uso. Le aliquote possono essere mantenute a 4 gradi; C per non più di una settimana. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| Acido ascorbico | Sigma | A4544-25G | Preparare le scorte a 10 mg/ml in acqua. Conservare le aliquote a -20 ° C nel buio. Aggiungere all'EBM alla concentrazione finale (500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm piastre di coltura | Becton Dickinson | 353001 | |
| Raschietto cellulare | Corning Incorporated | 3008 | |
| piastre a 12 pozzetti | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox vetrini per camera a 2 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| Vetrini in vetro a 2 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| Piastre a 6 pozzetti, superficie di attacco ultra-bassa | Corning Incorporated | 3471 | |
| Ago 18G | Becton Dickinson | 304622 | |
| Pipette pasteur in vetro, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Siringa da 2,5 ml | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF Workstation | KSystem, di Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscopio | Nikon |
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