A Caenorhabditis elegans Sistema modello per Amylopathy Studio

Sommario

Descriviamo i metodi per studiare aspetti della amylopathies nel verme C. elegans. Mostriamo come costruire i vermi che esprimono Ap umano ₄₂ Nei neuroni e come testare la loro funzione in saggi comportamentali. Mostriamo ulteriormente come ottenere colture neuronali primarie che possono essere utilizzati per il test farmacologico.

Abstract

Amylopathy è un termine che descrive la sintesi e l'accumulo anomalo di beta amiloide (Ap) nei tessuti con tempo. Ap è un segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) e si trova nella demenza a corpi di Lewy, miosite da corpi inclusi e angiopatia amiloide cerebrale ^1-4. Amylopathies progressivamente si sviluppano con il tempo. Per questo motivo gli organismi semplici con brevi durate di vita possono aiutare a chiarire gli aspetti molecolari di queste condizioni. Qui, descriviamo protocolli sperimentali per lo studio neurodegenerazione Ap-mediata utilizzando verme Caenorhabditis elegans. Così, costruiamo vermi transgenici iniettando il DNA codificante Ap umano ₄₂ nelle gonadi sinciziale di ermafroditi adulti. Linee trasformanti sono stabilizzate da una integrazione mutagenesi indotta. Nematodi sono sincronizzati età raccogliendo e seminando loro uova. La funzione dei neuroni che esprimono Ap ₄₂ viene testato in saggi comportamentali opportune (chemiotassi assays). Colture primarie neuronali ottenute da embrioni vengono utilizzati per integrare i dati comportamentali e per testare gli effetti neuroprotettivi di composti anti-apoptotici.

Introduzione

Beta amiloide (Ap) è un peptide di 36-43 aminoacidi che si forma a seguito della scissione sequenziale della proteina precursore dell'amiloide (APP) per β e γ secretasi ^1. Il γ secretasi elabora l'estremità C-terminale del peptide Ap ed è responsabile per le sue lunghezze variabili ^5. Le forme più comuni di Ap sono Ap ₄₀ Ap e _42, quest'ultimo essendo più comunemente associato a condizioni patologiche come ⁵ AD. Ad alte concentrazioni Ap forma β-sheets che aggregano a formare fibrille amiloidi ^6. Depositi di fibrille sono il componente principale delle placche senili che circondano i neuroni. Entrambe le targhe e diffusibili, oligomeri Ap non placca, si pensa di costituire le forme patogene sottostanti Ap.

Studio di laboratorio di amylopathies neuronali è complicata dal fatto che queste condizioni progresso con il tempo. Pertanto, è important di sviluppare modelli animali geneticamente trattabili-complementari a topi-con vita breve. Questi modelli possono essere utilizzati per spiegare aspetti specifici di amylopathies-tipicamente cellulare e molecolare e in virtù della loro semplicità, aiutare a catturare l'essenza del problema. Il verme Caenorhabditis elegans cascate è questa categoria. Ha una durata di vita breve, ~ 20 giorni e in aggiunta i processi cellulari di base tra cui regolazione dell'espressione genica, traffico di proteine, connettività neuronale, sinaptogenesi, segnalazione cellulare e la morte sono simili ai mammiferi ^7. Le caratteristiche uniche del worm includono la genetica potenti e la mancanza di un sistema di vasi, che permette di studiare i danni neuronali indipendentemente da danno vascolare. D'altra parte, la mancanza di un cervello limita l'uso di C. elegans per studiare molti aspetti della neurodegenerazione. Inoltre, la riproduzione e identificazione di distribuzioni anatomiche delle lesioni non possono essere eseguite in questo organismo. Altro limitezioni comprendono la difficoltà di valutare sia le differenze nei profili di espressione genica e di valore di un comportamento complesso e funzione di memoria. Qui si descrivono i metodi per generare C. elegans modelli di amylopathies.

Protocollo

1. Costruzione di Worms transgenici

1. Trasformazione.
   1. Preparare pad iniezione. Mettere una goccia di caldo, 2% agarosio sciolto in acqua, su un vetrino di vetro. Introdurre rapidamente un secondo vetrino sulla goccia e toccare leggermente lo. Dopo l'agarosio si è solidificato, vetrini di diapositive a parte, e cuocere il coprioggetto-pad in un forno sotto vuoto a 80 ° CO / N.
   2. Tirare pipette. Usiamo un Sutter P-97 estrattore di tirare 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capillari con filamento. Pipettes sono forgiati con punta chiusa che è rotto aperto in una fase successiva.
   3. Preparare mix di iniezione. Rendere la miscela iniettabile contenente il DNA di interesse (20 ng / pl per costrutto) più DNA plasmide vuoto ad una concentrazione finale di 150 ng / ml. Centrifugare la miscela di iniezione per rimuovere qualsiasi contaminante. Questo passaggio è fondamentale perché contaminanti riducono l'efficienza di trasformazione. Trasferire la top 5 microlitri (sporco e altri residui raccolgono sul fondo) in una nuova provetta per be usato in iniezione.
   4. Caricare mix iniezione per capillarità. La parte inferiore della pipetta è immerso nella miscela di iniezione. Tipicamente 0,5 ml sono sufficienti per iniettare 100 vermi.
   5. Caricare pipetta di iniezione. Inserire la pipetta sul supporto del micromanipolatore e romperlo aperto sfregando la punta contro il bordo di un vetrino montato su un vetrino o alternativamente contro detriti sul pad agarosio. Questo è un passo fondamentale in quanto troppo grande danno consigli del worm e troppo piccoli suggerimenti sono facilmente ostruiti. La qualità della punta rotta può essere giudicata dalla forma e soprattutto per la portata. La portata può essere valutato dalla dimensione delle bolle che scorre dalla punta aperta immersi in una goccia di olio 700 halocarbon in risposta ad una pressione di iniezione.
   6. Trasferire i vermi a pad iniezione. Mettere una goccia di olio di 700 halocarbon su un tappetino di iniezione e trasferire più (1 o 2 per i principianti) vermi per l'olio. Utilizzare un verme scegliere di spingere i vermi giù sul pad fino a quando ily aderire alla agarosio. Vermi devono essere orientati in righe con lati ventrali rivolte nella stessa direzione. Evitare di toccare la testa del verme. Se dopo vari tentativi i vermi non riescono ad aderire al pad, sostituire con un tampone fresco o aumentare agarosio spessore e / o la concentrazione.
   7. Inserire la pipetta nel verme. Spostando la fase, posizionare il verme sotto la pipetta. Posizionare la pipetta nel nucleo centrale della gonade perché il suo citoplasma è condivisa da molti nuclei delle cellule germinali. Questo aumenta la probabilità di consegnare DNA iniettato a molti progenie. La pipetta deve trovarsi quasi parallela alla vite senza fine (~ 15 ° -25 °). Spingere verticalmente la punta della pipetta lungo il corpo del verme finché la pelle è premuto. Quindi toccare delicatamente sul manipolatore di indurre l'inserimento della punta. Per ottenere i migliori risultati di iniettare due gonadi.
   8. Iniettare la soluzione di DNA. Applicare una pressione per la pipetta fino a quando le si gonfia gonade. Arrestare il flusso e tirare il verme al largo della pipetta. Testare l'ago per il flusso e quindi spostareal prossimo verme e gradini iniezioni ripetute.
   9. Recuperare i vermi: Aggiungere una goccia (~ 10 ml) di tampone di recupero sui vermi e incubare fino a quando i vermi cominciano nuoto. Aggiungere un uguale volume di M9, attendere vermi riprendere il nuoto e ripetere più volte fino a quando la soluzione è per lo più M9. Individualmente trasferire i vermi a piastre seminate.
2. Integrazione.
   1. Mettere 40 sano, ben nutrito, L4 vermi in un piatto fresco
   2. Irradiate con γ-ray con 4.000 rad per 40 min. Trasferire vermi irradiati (P0) in OP50 piatti freschi, testa di serie (4 vermi / piastra). I worm possono in alternativa essere irradiati con una dose di 300 J / m ² UV.
   3. Trasferire 10-20 trasformanti F1 da ciascun piatto per piatti individuali, etichettare le piastre con il corrispondente P0 origine.
   4. Singolo fuori 2-4 trasformanti F2 per ogni F1 per piatti separati. Controllare la progenie F3 per la trasmissione 100% del marcatore trasformazione. Tipicamente, 1-3% di progenie da un worm wil irradiatoDevo un evento di integrazione.
   5. Fare scorte di tre o più linee trasformanti indipendenti.

2. Saggi comportamentali

1. Age-sincronizzazione.
   1. Crescere vermi nello standard 10 centimetri piastre NGM + OP50 E. coli fino ad una vasta popolazione di adulti gravide viene raggiunto (3-5 giorni).
   2. Raccogliere i vermi in 50 ml provette Falcon da loro sospensione in 1 ml di tampone M9.
   3. Aggiungere 5 ml di tampone M9 e centrifugare a 450 xg per 3 min. Scartare il surnatante. Ripetere 3-4x.
   4. Alla fine dell'ultima centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere 10 volumi di soluzione di ipoclorito di base (0,5 M NaOH, 1% ipoclorito appena miscelato) per i vermi pellet. Incubare a temperatura ambiente per circa 10 minuti. La reazione può essere monitorato lisi mettendo una goccia della reazione lisi su un vetrino ed esaminando i vermi sotto un microscopio. Quando circa il 80% dei vermi sono rotti la reazione deve essere interrotto.
   5. Arrestare la reazione di lisi da adding lo stesso volume di tampone sterile uovo.
   6. Raccogliere le uova (e carcasse) per centrifugazione a 450 xg per 5 min.
   7. Lavare le uova con tampone sterile uovo 2-3x.
   8. Incubare le uova di O / N in tampone M9 e loro su piastre NGM standard di seme.
2. Saggio di chemiotassi.
   1. Preparare diversi pezzi di agar circa 0.5x0.5x0.5 cm. Abbiamo depositare l'agar-agar in un piatto da 10 cm e abbiamo tagliato i pezzi di agar da lì.
   2. Mettere a bagno il pezzo agar in una soluzione contenente l'attrattivo desiderata (a saturazione, le concentrazioni di quasi saturazione) per 2 ore. Attrattivi tipici sono lisina (0,5 M), biotina (0,2 M).
   3. Depositare un chunk agar in una piastra di prova 10 cm, in cui la posizione di un luogo di prova e un punto di controllo sono stati contrassegnati (Figura 1A). Raggiungere l'equilibrio e la formazione di un gradiente di O / N (Figura 1B). Preparare 5 piastre per un singolo esperimento.
   4. Prima dell'esperimento aggiungere 10 ml di 20 mM NaN ₃ (Anesthetic) per ogni spot.
   5. Collocare 20 vermi età sincronizzate nel centro della piastra. Porre la piastra in incubatore a 20 ° C.
   6. Dopo 1 ora, contare gli animali sui punti di prova / controllo e di calcolare l'indice di chemiotassi, (CI) come segue: dove N, N e N _{Cnt prova.,} indicano il numero totale di animali, il numero di animali nel punto di prova e il numero di animali nel punto di controllo.

3. Primaria Embryonic Cell Culture

1. Lyse vermi come descritto in età-sincronizzazione.
2. Arrestare la reazione di lisi aggiungendo lo stesso volume di tampone sterile uovo e centrifugare a 450 xg per 5 min. Scartare il surnatante delicatamente facendo attenzione a non perdere le uova pellet. Ripeti 2-3x o fino a quando il surnatante è chiaro.
3. Risospendere pellet (uova e carcasse) In 2 ml di tampone sterile uovo e aggiungere 2 ml di soluzione sterile di 60% di saccarosio in tampone uovo. Mescolare questa soluzione fino a quando le uova sono completamente risospese (in quanto tendono a formare grumi sotto la centrifugazione) a mano o con il vortex.
4. Centrifugare a 450 xg per 15 min.
5. Trasferire accuratamente surnatante (contenente le uova) in una provetta sterile. Scartare pellet che contiene le carcasse e di altri sottoprodotti di lisi.
6. Rimuovere saccarosio residuo risospendendo le uova in tampone uovo e centrifugazione a 450 xg per 5 min. Raccogliere delicatamente e scartare il surnatante. Ripetere 3 volte.
7. Sotto una cappa laminare sospendere di nuovo le uova pellet in tampone uovo sterile contenente 1 U / ml chitinasi a RT per digerire i gusci d'uovo. Dopo 30 min iniziare a monitorare la reazione (sotto un microscopio coltura cellulare invertito). Ogni serie di chitinasi ha un'attività leggermente diversa. Tipicamente digestione è completato in 1 ora.
8. Quando circa 70-80% gusci d'uovo vengono digeriti da chitinasi add CM-15 (L-15 di coltura cellulare medium contenente 10% siero fetale bovino, 50 U / ml di penicillina, e 50 ug / ml streptomicina). Dissociare le cellule usando una siringa con una calibro 27. Filtrare la sospensione cellulare con un 5,0 micron filtro per eliminare gli embrioni intatti, grumi di cellule e larve.
9. Pellet la sospensione cellulare dissociato mediante centrifugazione a 450 xg per 15 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in CM-15 terreno di coltura cellulare.
10. Piastra cellule dissociate sul coperchio di vetro scivola precedentemente rivestiti con arachidi lectina (0,1 mg / ml) disciolto in acqua. Nota: le cellule devono aderire al substrato al fine di differenziare.
11. Cellule possono essere mantenute a TA (16-20 ° C) in aria per più di 2 settimane.

Risultati

Con i nostri protocolli si studiano gli effetti di Ap umano ₄₂ oligomero sulla funzione neuronale ^8. Un frammento codificante Ap umano ₄₂ e il peptide segnale codificante sequenza artificiale di fuoco vettore pPD50.52 è stato amplificato dal costrutto PCL12 ⁹ utilizzando primer che hanno introdotto un sito di endonucleasi di restrizione 1 Sma alle estremità. Il frammento è stato poi inserito in un costrutto contenente un FLP-6 sequenza promotrice 2.481 bp nel fuoco ve...

Discussione

Qui si descrive un approccio combinato, per studiare gli aspetti cellulari e molecolari delle amylopathies utilizzando C. elegans. I vantaggi di questo approccio includono:. 1) basso costo C.elegans è mantenuta in normali Petri seminato con batteri, a temperatura ambiente. 2) genetica potente. Animali transgenici possono essere ottenuti in pochi mesi e alla vasta gamma di sequenze promotore è disponibile per guidare l'espressione del gene desiderato in neuroni specifici. 3), ben caratterizzato, sis...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Batteriologico agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptone	AMRESCO	J636	2,5 g
Acqua			Portare a 975 ml
Sterilizzato in autoclave, quindi aggiungere i seguenti elementi e mescolare bene
Solfato	di magnesioSigma-Aldrich	M2643	1 ml di 1 M stock
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml di 1 M stock
Colesterolo	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml di 5 mg/ml di stock (in etanolo)
Tampone			25 ml di 1M stock
2. Tampone fosfato di potassio
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Acqua			Portare a 1 L
Sterilizzato in autoclave<
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Sodio fosfato bibasico	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml di 1 M stock
Acqua			Portare a 1 L
Sterilizzato in autoclave
4. Tampone uovo (pH 7,3, 340 mOsm)
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Acqua			Portare a 1 L
Sterilizzato in autoclave
5. CM-15
L-15 terreno di coltura	Gibco	11415	450 ml
Siero fetale bovino	Gibco	10437-028	50 ml
Penicillina	Gibco	15140	50 unità/ml
Streptomicina	Gibco	15140	50 g/ml<
6. Altri reagenti
Halocarbon 700 oil	Prodotti alocarburi	9002-83-9
5 μ m Filtro per siringa Acrodisc	PALL Co.	4199
Chitinasi	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectina (arachidi)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	S320
Lisina	Sigma-Aldrich	L5501
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Soluzione di ipoclorito di sodio	Sigma-Aldrich	425044
Sodio azide	Sigma-Aldrich	71289
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389