A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Sommario

Descriviamo i metodi per studiare aspetti della amylopathies nel verme C. elegans. Mostriamo come costruire i vermi che esprimono Ap umano ₄₂ Nei neuroni e come testare la loro funzione in saggi comportamentali. Mostriamo ulteriormente come ottenere colture neuronali primarie che possono essere utilizzati per il test farmacologico.

Abstract

Amylopathy è un termine che descrive la sintesi e l'accumulo anomalo di beta amiloide (Ap) nei tessuti con tempo. Ap è un segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) e si trova nella demenza a corpi di Lewy, miosite da corpi inclusi e angiopatia amiloide cerebrale ^1-4. Amylopathies progressivamente si sviluppano con il tempo. Per questo motivo gli organismi semplici con brevi durate di vita possono aiutare a chiarire gli aspetti molecolari di queste condizioni. Qui, descriviamo protocolli sperimentali per lo studio neurodegenerazione Ap-mediata utilizzando verme Caenorhabditis elegans. Così, costruiamo vermi transgenici iniettando il DNA codificante Ap umano ₄₂ nelle gonadi sinciziale di ermafroditi adulti. Linee trasformanti sono stabilizzate da una integrazione mutagenesi indotta. Nematodi sono sincronizzati età raccogliendo e seminando loro uova. La funzione dei neuroni che esprimono Ap ₄₂ viene testato in saggi comportamentali opportune (chemiotassi assays). Colture primarie neuronali ottenute da embrioni vengono utilizzati per integrare i dati comportamentali e per testare gli effetti neuroprotettivi di composti anti-apoptotici.

Introduzione

Beta amiloide (Ap) è un peptide di 36-43 aminoacidi che si forma a seguito della scissione sequenziale della proteina precursore dell'amiloide (APP) per β e γ secretasi ^1. Il γ secretasi elabora l'estremità C-terminale del peptide Ap ed è responsabile per le sue lunghezze variabili ^5. Le forme più comuni di Ap sono Ap ₄₀ Ap e _42, quest'ultimo essendo più comunemente associato a condizioni patologiche come ⁵ AD. Ad alte concentrazioni Ap forma β-sheets che aggregano a formare fibrille amiloidi ^6. Depositi di fibrille sono il componente principale delle placche senili che circondano ....

Protocollo

1. Costruzione di Worms transgenici

1. Trasformazione.
   1. Preparare pad iniezione. Mettere una goccia di caldo, 2% agarosio sciolto in acqua, su un vetrino di vetro. Introdurre rapidamente un secondo vetrino sulla goccia e toccare leggermente lo. Dopo l'agarosio si è solidificato, vetrini di diapositive a parte, e cuocere il coprioggetto-pad in un forno sotto vuoto a 80 ° CO / N.
   2. Tirare pipette. Usiamo un Sutter P-97 estrattore di tirare 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capillari con filamento. Pipettes sono forgiati con punta chiusa che è rotto aperto in una fase successiva.
   3. Preparare mix di iniezione. Rendere la miscela iniettabil....

Risultati

Con i nostri protocolli si studiano gli effetti di Ap umano ₄₂ oligomero sulla funzione neuronale ^8. Un frammento codificante Ap umano ₄₂ e il peptide segnale codificante sequenza artificiale di fuoco vettore pPD50.52 è stato amplificato dal costrutto PCL12 ⁹ utilizzando primer che hanno introdotto un sito di endonucleasi di restrizione 1 Sma alle estremità. Il frammento è stato poi inserito in un costrutto contenente un FLP-6 sequenza promotrice 2.481 bp nel fuoco ve.......

Discussione

Qui si descrive un approccio combinato, per studiare gli aspetti cellulari e molecolari delle amylopathies utilizzando C. elegans. I vantaggi di questo approccio includono:. 1) basso costo C.elegans è mantenuta in normali Petri seminato con batteri, a temperatura ambiente. 2) genetica potente. Animali transgenici possono essere ottenuti in pochi mesi e alla vasta gamma di sequenze promotore è disponibile per guidare l'espressione del gene desiderato in neuroni specifici. 3), ben caratterizzato, sis.......

Materiali

3. M9 tampone distillata distillata td colspan="4">Regolare a 340 mOsm con saccarosio, quindi filtrare sterile in flaconi autoclavati e conservare a 4 ° C

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Batteriologico agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptone	AMRESCO	J636	2,5 g
Acqua			Portare a 975 ml
Sterilizzato in autoclave, quindi aggiungere i seguenti elementi e mescolare bene
Solfato	di magnesioSigma-Aldrich	M2643	1 ml di 1 M stock
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml di 1 M stock
Colesterolo	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml di 5 mg/ml di stock (in etanolo)
Tampone			25 ml di 1M stock
2. Tampone fosfato di potassio
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Acqua			Portare a 1 L
Sterilizzato in autoclave<
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Sodio fosfato bibasico	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml di 1 M stock
Acqua			Portare a 1 L
Sterilizzato in autoclave
4. Tampone uovo (pH 7,3, 340 mOsm)
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Acqua			Portare a 1 L
Sterilizzato in autoclave
5. CM-15
L-15 terreno di coltura	Gibco	11415	450 ml
Siero fetale bovino	Gibco	10437-028	50 ml
Penicillina	Gibco	15140	50 unità/ml
Streptomicina	Gibco	15140	50 g/ml<
6. Altri reagenti
Halocarbon 700 oil	Prodotti alocarburi	9002-83-9
5 μ m Filtro per siringa Acrodisc	PALL Co.	4199
Chitinasi	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectina (arachidi)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	S320
Lisina	Sigma-Aldrich	L5501
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Soluzione di ipoclorito di sodio	Sigma-Aldrich	425044
Sodio azide	Sigma-Aldrich	71289
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389

distillata fosfato di potassio distillata td colspan="4">