Stimolazione nervosa infrarossi è stato proposto come alternativa alla stimolazione elettrica in una gamma di tipi nervose, comprese quelle associate al sistema uditivo. Questo protocollo descrive un metodo patch clamp per studiare il meccanismo di stimolazione nervosa infrarossa in una cultura di neuroni uditivi primari.
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Articolo metodologico
Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stato dimostrato negli ultimi anni che pulsata, luce laser infrarosso può essere utilizzato per ottenere risposte elettrici nel tessuto neurale, indipendente da qualsiasi ulteriore modifica del tessuto bersaglio. Stimolazione neurale infrarossi è stato riportato in una varietà di tessuto neurale e sensoriali periferici in vivo, con particolare interesse mostrato nella stimolazione di neuroni nel nervo uditivo. Tuttavia, mentre INS ha dimostrato di funzionare in queste impostazioni, il meccanismo (o meccanismi) attraverso il quale la luce infrarossa causa l'eccitazione neurale è attualmente poco compreso. Il protocollo presentato qui descrive un metodo di patch clamp cellula intera progettato per facilitare le indagini di stimolazione neurale infrarossi in colture di neuroni uditivi primari. Dal fondo caratterizzare la risposta di queste cellule di illuminazione laser infrarosso in vitro in condizioni controllate, può essere possibile ottenere una migliore comprensione del physica fondamentalel ed i processi biochimici sottostanti stimolazione neurale infrarossi.
Introduzione
I campi della neurofisiologia e della bionica medica si basano molto sulle tecniche che consentono la stimolazione controllabile di risposte elettriche nei tessuti nervosi. Mentre la stimolazione elettrica rimane il gold standard nella eccitazione neurale, soffre di una serie di inconvenienti, quali la presenza di artefatti di stimolazione quando si registra risposte neurali, e una mancanza di stimolazione specificità dovuta alla diffusione di corrente nel tessuto circostante 1.
Gli ultimi due decenni hanno visto lo sviluppo di tecniche di stimolazione otticamente mediate 2. Molte di queste tecniche richiede modifica....
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Protocollo
1. Cultura di spirale neuroni dei gangli
- Sterilizzare piccolo rotondo (ad esempio diametro 10 mm) vetrini e pinze curve in autoclave. Trasferire i coprioggetti sterilizzati in singoli pozzetti di una 4-ring 35 millimetri capsula di Petri sterile o piastra 4-bene, usando le pinze sterilizzate. Applicare 150 ml di poli-L-ornitina (500 mcg / ml) e mouse laminina (0,01 mg / ml) alla superficie superiore del coprioggetto e posto in un incubatore (37 ° C) fino a 48 ore. Assicurarsi che i vetrini non galleggiano lontano dal fondo del pozzo.
- Preparare 50 ml supporti Neurobasal sterili (NBM) per ogni cultura neurale: 47.5 ml Neurobasal A, 0,5 ml ....
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Risultati
Neuroni gangliari spirale rispondono al laser con illuminazione ripetibile in entrambe le forme d'onda di tensione-clamp e configurazioni di registrazione corrente-clamp. Figura 3a mostra tipici cambiamenti nel flusso di corrente attraverso una membrana cellulare in risposta a un 2,5 msec, 0,8 mJ impulsi laser (risposta media da 6 impulsi laser, ripetuti ad intervalli di 1 sec) con il potenziale di membrana tenutosi a -70 mV, -60 mV e -50 mV. Le correnti in entrata netti sono costantemente evocati i.......
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Discussione
Utilizzando i protocolli descritti in questo documento è possibile estrarre e cultura spirale neuroni gangliari e di indagare laser evocata attività elettrica eseguendo interi esperimenti di patch clamp cellulari. Quando utilizzato in vitro, la tecnica patch clamp fornisce un livello di controllo sui parametri sperimentali che non è realizzabile in vivo. Parametri di stimolazione laser come lunghezza d'onda, di impulsi di energia, lunghezza di impulso, forma d'impulso, e sequenze di ripetizione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di Ricerca Australiano sotto Linkage Progetto concessione LP120100264.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali e attrezzature per colture cellulari | |||
| Vetrini coprioggetti | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring piastra per colture cellulari | VWR International | 82050-542 | |
| Soluzione di poli-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curvo pinze | WPI | 14101 | Pinzette Dumont #5 (punta angolare 45°) |
| CO2 Incubatore | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Tabella 1. Materiali e attrezzature per colture cellulari. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| Integratore N-2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 integratore senza siero | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutammina | Invitrogen | 25030-149< | |
| strong>Soluzione intracellulare | |||
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| D-gluconato di potassio | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Idrossido di potassio | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Soluzione extracellulare | |||
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Idrossido di sodio | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Tabella 2. Soluzioni per colture cellulari e patch clamp. a) Terreni neurobasali. b) Soluzione intracellulare. c) Soluzione extracellulare. | |||
| Microscopio verticale | Zeiss | AxioExaminerD1 | Dotato di contrasto Dodt |
| Obiettivo ad immersione in acqua | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Piattaforma e tavolino X-Y | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Camera di registrazione | Warner Instruments | RC-26G | |
| Tavolo di isolamento dalle vibrazioni | TMC | Micro-g 63-532 | |
| diagnostici | per telecamera CCD | RT1200 | |
| Software per telecamera | Strumenti diagnostici | SPOT Basic | |
| Riscaldatore per soluzioni in linea | Warner | SH-27B | |
| Regolatore di temperatura | Warner | TC-324B | |
| Amplificatore patch clamp | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp sistema di acquisizione dati | Molecular Devices Digidata | 1440A | |
| Micromanipolatore | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Vetro per micropipette | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Vetro borosilicato con filamento |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instruments | P2000 | |
| Software di registrazione | AxoGraph | Lab pack e strumenti di elettrofisiologia | |
| Flacone aspiratore | Sigma-Aldrich | CLS12201L | Flacone aspiratore Pyrex da 1 L, con uscita per tubi |
| Tubo PE Pompa | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1.870 nm diodo laser | Optotech | ||
| 200/220 μ m diametro cavo patch in fibra ottica multimodale (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Fibra ottica di erogazione della luce, nucleo e rivestimento in silice, 0,22 NA |
| Fibra ottica attraverso il connettore (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Mannaia per fibra ottica | EREM | FO1 | |
| Strumento di spelatura della fibra ottica (0,25 - 0,6 mm) | Siemens | Per la rimozione del rivestimento in fibra ottica | |
| Strumento di spelatura della fibra ottica (0,6 - 1,0 mm) | Siemens | Per la rimozione del rivestimento esterno del cavo patch | |
| Generatore | Qualsiasi generatore di segnale in grado di emettere le forme di impulso necessarie ed è in grado di essere attivato esternamente | ||
| Posizionatore in fibra ottica Posizionatore | su misura. Potrebbe sostituire con il microposizionatore standard utilizzato per gli esperimenti di patch clamp | ||
| Mandrino in fibra ottica | Newport | FPH-DJ | |
| Misuratore di potenza laser e testa rivelatrice | Coherent | FieldMate (misuratore di potenza) con LM-3 (testa rivelatore) | |
| Tabella 4. Apparecchiature laser. |
Riferimenti
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical rad....
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Ristampe e permessi
