Adenovirale trasferimento genico nelle cellule T CD4 naive con transgenici espressione del recettore adenovirus Coxsackie permette l'analisi molecolare della differenziazione delle cellule T regolatorie In vitro.
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Articolo metodologico
Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule T regolatorie (Treg) sono essenziali per fornire la tolleranza immune da auto così come a certi antigeni estranei. Tregs può essere generato da CD4 naive cellule T in vitro con TCR-e co-stimolazione in presenza di TGFβ e IL-2. Questo porta il potenziale enorme per terapie future, tuttavia, le molecole e vie di segnalazione che la differenziazione di controllo sono in gran parte sconosciuti.
Cellule T primarie possono essere manipolati attraverso l'espressione genica ectopica, ma non riescono metodi comuni di indirizzare il più importante stato naif della cellula T prima del riconoscimento dell'antigene primaria. Qui, forniamo un protocollo di esprimere geni ectopiche nelle cellule T CD4 naive in vitro prima di indurre la differenziazione Treg. Si applica la trasduzione con l'adenovirus replica-carente e spiega la sua generazione e la produzione. L'adenovirus può occupare una grande inserti (fino a 7 kb) e può essere dotato di promotori per realizzare alta e transitori Sovraespression nelle cellule T. E trasduce efficacemente le cellule T naive topo se esprimono un recettore adenovirus Coxsackie transgenico (CAR). Importante, dopo l'infezione le cellule T naive rimangono (CD44 bassa, alta CD62L) e di riposo (CD25 -, CD69 -) e possono essere attivate e differenziate in Tregs simili alle cellule non infette. Così, questo metodo consente la manipolazione di cellule CD4 T differenziamento cellulare dal suo inizio. Essa assicura che l'espressione genica ectopica è già in atto quando i primi eventi di segnalazione della stimolazione iniziale TCR induce cambiamenti cellulari che alla fine portano a Treg differenziazione.
Introduzione
Tregs sono cruciali per mantenere la tolleranza immunitaria e per smorzare le risposte immunitarie superamenti. Treg sopprimere l'attivazione delle cellule T astanti. Di conseguenza, l'ablazione del Tregs porta ad autoimmunità fatale e autodistruzione guidato da cellule T attivate 1. Treg sviluppano nel timo durante la selezione negativa dei CD4 precursori single-positive, ma possono anche differenziarsi in periferia da CD4 naive cellule T dopo stimolazione antigene a basso dosaggio con subottimale di co-stimolazione 1,2. Timica Treg sembra sopprimere l'autoimmunità tessuto contro auto-antigeni, mentre periferica Treg sono stati impl....
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Protocollo
1. La clonazione di un gene di interesse in un vettore di ingresso
- Clonare il gene di interesse in un vettore di ingresso. Amplificazione PCR del gene seguita da ligazione smussato-end in un vettore topoisomerasi-coupled (es pENTR / D-TOPO) o di restrizione enzimatica clonazione può essere utilizzato per questa procedura.
2. Trasferimento del gene di interesse nel pCAGAdDu destinazione Vector
- Trasferire il gene di interesse da parte del vettore di ingresso nel vettore di destinazione dalla LR ricombinazione (es. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Questo creerà il vettore di espressione adenovi....
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Risultati
Virus Produzione
Per la generazione di viremia elevata, i tempi di raccolta delle cellule HEK293A nella produzione di virus primaria o amplificazione del virus è di fondamentale importanza. Rappresentativi immagini a contrasto di fase e fluorescenza con segni visivi di produzione di virus sono mostrati in Figura 3. Il CPE è stata osservata 10 giorni dopo la transfezione di cellule HEK293A con pCAGAdDu controllo vettoriale senza inserto. CPE sono caratterizzate dalla comparsa di.......
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Discussione
Generazione Virus e titolazione
Per risultati ottimali trasfezione, la qualità e la quantità di vettore linearizzato appaiono più importante. Non abbiamo osservato effetti negativi sulla produzione di lisato primaria da una crescita eccessiva iniziale della cultura in quanto l'infezione procede rapidamente una volta che la produzione di virus efficiente verifica. Tuttavia, la produzione di virus dalle cellule HEK293A può essere influenzata da lunghi inserti che diminuiscono l'efficienza.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Lirui Du per la costruzione del vettore pCAGAdDU e Oliver Gorka per disposizione del protocollo di fissazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di clonazione pENTR/D-TOPO | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonasi II Miscela enzimatica | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Linea cellulare | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | Piastre a 6 pozzetti CCL-185 | |
| BD Falcon | 353046 | ||
| piastra per coltura tissutale da 14 cm | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ 1)1Jdgr | Taconic Farms | Modello n. 4285 | |
| Kit di isolamento delle cellule T CD4+ Naive II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPiruvato | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutammina | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Soluzione tampone (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Miscela vitaminica essenziale (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 per l'espansione e l'attivazione cellulare | Invitrogen | 114-56D | |
| TGF-beta umano ricombinante 1 | R& D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Kit di colorazione di cellule morte blu riparabile | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | ||
| LightCycler 480 Sonde Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| Kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
Riferimenti
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H.
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Ristampe e permessi
