Descriviamo qui un metodo biochimico accurato, riproducibile e conveniente per la titolazione del glicogeno in vitro. Questa tecnica utilizza il kit di analisi Abcam glicogeno e si basa sulla successiva idrolisi del glicogeno in glucosio e titolazione mediante fluorescenza.
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Articolo metodologico
Titolazione biochimica di glicogeno
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il glicogeno è la principale polimero energetico del glucosio negli animali vertebrati e svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo del corpo intero e nel metabolismo cellulare. Esistono già molti metodi per rilevare glicogeno, ma solo pochi sono di tipo quantitativo. Descriviamo qui un metodo che utilizza il kit di analisi Abcam Glicogeno, che si basa sulla specifica degradazione del glicogeno in glucosio da glucoamilasi. Il glucosio viene ossidato specificamente ad un prodotto che reagisce con la sonda OxiRed per produrre fluorescenza. La titolazione è preciso, sensibile e può essere realizzato su estratti cellulari o sezioni di tessuto. Tuttavia, a differenza di altre tecniche, non dà informazioni sulla distribuzione del glicogeno nella cellula. Come esempio di questa tecnica, descriviamo qui la titolazione di glicogeno in due linee cellulari, cinese CCL39 fibroblasti di polmone di criceto e LS174 carcinoma del colon umano, incubati in normossia (21% O 2) rispetto ipossia (1% O 2). Abbiamo ipotizzato che l'ipossia è un segnalenale che prepara le cellule per sintetizzare e conservare glicogeno per sopravvivere 1.
Introduzione
Il glicogeno è un polimero con molti rami di residui di glucosio, che è presente nel citoplasma di molti tipi di cellule. È una delle principali forme di immagazzinamento dell'energia nelle cellule e svolge un ruolo importante nel metabolismo del glucosio. La maggior parte delle cellule di mammiferi sono capaci di produrre e immagazzinare glicogeno, che può essere rapidamente degradato in glucosio per promuovere la glicolisi e produzione di ATP durante lo stress metabolico. Gli epatociti producono enormi quantità di glicogeno per regolare il livello di zucchero nel sangue fornendo così un approvvigionamento continuo di glucosio nel corpo. Al contrario, la concent....
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Protocollo
Titolazione biochimica di glicogeno
1. Lisi cellulare
- Alveoli ad una concentrazione di 0,5-2 x 10 6 per ogni 100 mm di diametro piatto.
- Trattamento: incubare cellule 24, 48, o 72 ore a bassa concentrazione di ossigeno (ipossia) in una stazione di lavoro anaerobico Bug-Box (Ruskinn Tecnologia Biotrace International Plc, Bridgend, Regno Unito) fissato al 1% o 0,1% O 2, 94% o 94,9% N 2, e 5% di CO 2. Parallelamente, incubare le cellule in normossia (21% O 2, 5% CO 2). Cambiare mezzo (25 mM mezzo contenente glucosio) ogni 24 ore per minimizzare variazioni del....
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Risultati
Un basso livello di ossigeno (ipossia) in segnali tumori a cellule tumorali la necessità di immagazzinare energia per gestire conseguente esaurimento degli elementi nutritivi, in modo da sopravvivere. Come glicogeno è il principale polimero energetico del glucosio nelle cellule di mammifero, abbiamo studiato la regolazione della glicogenosi in ipossia. Il calcolo e la standardizzazione della concentrazione di glicogeno in lisati cellulari devono essere eseguite sui dati grezzi di fluorescenza come mostrato nelle
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Discussione
Titolazione biochimica di glicogeno in vitro permette una quantificazione precisa delle cellule contenuto di glicogeno. Rispetto ad altre tecniche (PAS, immunofluorescenza con un anticorpo glicogeno, ecc.), Questa titolazione è molto specifico, sensibile e riproducibile. Inoltre, il metodo è conveniente in quanto richiede nessuna radioattività ma uno spettrometro a fluorescenza. Tuttavia, questa tecnica è puramente quantitativa e non fornisce informazioni sulla distribuzione glicogeno nella cella.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Siamo grati al Dr. Thierry Pourcher per averci permesso di utilizzare lo spettrometro a fluorescenza e per il suo aiuto. Il laboratorio è finanziato dalla Ligue Nationale Contre le Cancer (équipe labellisée), l'Associazione pour la Recherche contre le Cancer, l'Institut National du Cancer (INCA), l'Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programma dell'UE 7 ° PQ), il Centro A. Lacassagne, il Centre National de la Recherche Scientifique, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale e l'Università di Nizza ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Ringraziamo il Dott. M Christian....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Kit di analisi del glicogeno | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Spettrometro a fluorescenza | PerkinElmer | LS 50B |
Riferimenti
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J<....
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Ristampe e permessi
