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Articolo metodologico

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

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⸱

DOI:

10.3791/50483

⸱

26 giugno 2013

 , 
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta una metodologia completa per preparare e conservare In vitro Acuta fettine di ippocampo di topi adulti. Questo protocollo permette la registrazione di potenziamento a lungo termine di lunga durata molto stabile (LTP) per più di 8 ore con un tasso di successo del 95%.

Abstract

Potenziamento a lungo termine (LTP) è un tipo di plasticità sinaptica caratterizzata da un aumento della forza sinaptica e crede di essere coinvolti nella codifica della memoria. LTP suscitato nella regione CA1 di fettine di ippocampo acute è stata ampiamente studiata. Tuttavia i meccanismi molecolari alla base della fase di questo fenomeno manutenzione sono ancora poco conosciuti. Questo potrebbe essere dovuto in parte alle diverse condizioni sperimentali utilizzate da diversi laboratori. Infatti, la fase di mantenimento LTP è fortemente dipendente da parametri esterni come ossigenazione, temperatura e umidità. Esso dipende inoltre parametri interni come orientamento del piano di tranciatura e vitalità fetta dopo dissezione.

L'ottimizzazione di tutti questi parametri permette l'induzione di un potenziamento molto riproducibile e molto stabile a lungo termine. Questa metodologia offre la possibilità di esplorare ulteriormente i meccanismi molecolari coinvolti nella crescita stabilein forza sinaptica in fettine di ippocampo. Si evidenzia anche l'importanza delle condizioni sperimentali in vitro in indagini di fenomeni neurofisiologici.

Introduzione

Al giorno d'oggi, non vi è limitata comprensione di come le memorie complesse vengono memorizzate e richiamate a livello di circuito neuronale. Tuttavia, un'ipotesi unificante di memoria è disponibile e ampiamente riconosciuti: memorie sono memorizzati come cambiamenti nella forza delle connessioni sinaptiche tra i neuroni nel sistema nervoso centrale. Di per sé, la ricerca sulla plasticità sinaptica ha largamente beneficiato di due scoperte svolta. (1) In un esperimento seminale, Bliss e Lomo 1, utilizzando il coniglio anestetizzato intatta, trovato che la consegna di una breve alta frequenza (1 sec, 100 Hz) impulso alla via perforante dell'ippocampo causato una lunga durata (vari ore) aumento delle relative connessioni sinaptiche. Questo fenomeno affascinante è stato chiamato "potenziamento a lungo termine" o LTP da Douglas e Goddard nel 1975 2. (2) Successivamente, è stato trovato che un fenomeno simile potrebbe essere innescato in fettine cerebrali (0,4 mm) mantenuta artificialmente in vita in vitro . La LTP più studiato è stato osservato in vitro, fornendo uno o più tetani ad un fascio di assoni (cosiddetti collaterali Schaffer) durante la registrazione del campo risultante sinaptica eccitatoria potenziale evocato nei neuroni piramidali della cosiddetta regione CA1. I meccanismi di induzione di LTP sono stati ampiamente rivelato. Fondamentalmente, un afflusso di Ca 2 + attraverso i recettori NMDA attiva enzimi con due conseguenze: una fosforilazione di recettori AMPA (che aumenta la loro efficienza) e una incorporazione di recettori AMPA extra nella membrana postsinaptica 3. Per contro, i meccanismi della fase di mantenimento LTP sono largamente sconosciuti, soprattutto perché é sperimentalmente molto più difficile mantenere una fetta sano per molte ore che per 30 a 60 min.

Molti studi sono stati dedicati alla comprensione dei meccanismi di LTP e teorie interessanti sono state elaborate nel corso degli anni, 4-11. Ma ONUfino ad ora, i meccanismi molecolari precisi alla base della crescita stabile in forza sinaptica non sono stati chiariti. Questo potrebbe essere dovuto alla difficoltà di riprodurre i risultati precedenti in laboratori diversi utilizzando tecniche diverse per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali. Nel loro documento metodologia, Sajikumar et al. 12 ha sottolineato l'importanza delle condizioni sperimentali per la preparazione di fettine di ippocampo di ratto e la registrazione delle LTP stabile. In questo video vi presentiamo tutte le fasi di ottimizzazione sviluppati nel nostro laboratorio nel corso degli anni di essere in grado di registrare un LTP molto stabile nel topo fettine di ippocampo.

Questa ottimizzazione è stata fatta dai protocolli sviluppati e utilizzati con successo da altri laboratori che studiano i meccanismi di LTP in topi e ratti 13 11. Esso consente a ricercatori esperti di indurre e registrare un tempo molto lungo LTP duratura in topi adulti con un alto tasso di successo. Il pbase hysiological della indotto LTP è stato attentamente verificato e dimostrato 14. In questo lavoro la metodologia, si dimostra che le modifiche delle condizioni sperimentali, come la temperatura o l'ossigenazione possono avere un profondo impatto sulla manutenzione LTP, mentre la procedura di dissezione può modificare profondamente le fette eccitabilità. Si deve inoltre sottolineare che il controllo preciso di tutti questi parametri richiede una formazione di diversi mesi per gli studenti alle prime armi.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of norme sanitarie per la cura e l'uso di animali nella ricerca e con l'accordo del comitato etico locale.

1. Preparazione del Artificial liquido cerebro-spinale

Lo stesso supporto utilizzato per sezionare, tagliare e perfusione fette (1 ml / min) durante il periodo di riposo e le registrazioni elettrofisiologiche. Questo supporto è composto da 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl 2, 1,3 mm MgSO 4 e 10 mm D-glucosio.

  1. Pesare i diversi componenti per 2 L di ACSF tranne MgSO4 che è già in soluzione (1 M). Usando una soluzione standard permette di essere sicuri della esatta concentrazione di Mg 2 + perché MgSO4 in polvere è altamente igroscopico. Ca 2 +: Mg2 + rapporto influenza notevolmente l'induzione e il mantenimento LTP14 e, quindi, le loro proporzioni vanno sempre rispettati.
  2. Mettere tutti i componenti ad eccezione CaCl 2 in un bicchiere cilindro graduato e portare a 2 L con acqua distillata H 2 O.
  3. Mescolare energicamente. Quando tutto è sciolto, aggiungere CARBOGEN attraverso un gorgogliatore acquario e il tubo attaccato al serbatoio (95% O 2, 5% di CO 2). Attendere qualche minuto e aggiungere cloruro di calcio quando il pH è fissato a 7,4 con l'azione del tampone bicarbonato.
  4. Tenere 600 ml in un piatto di vetro rettangolare refrigerato e raffreddare a 4 ° C con ghiaccio intorno al piatto. Questo supporto saranno utilizzati per la dissezione dell'ippocampo.
  5. Filtra i restanti 1.400 ml e conservare in una beuta.

2. Preparazione del Rig elettrofisiologici e cervello Slice Recording Camera

Il circuito di perfusione è fatto di due pompe peristaltiche, uno di pompaggio del liquido fresco da un serbatoio di riserva e l'altro fluido utilizzato pompaggio da tsi registra da camera per un bidone. Fluido fresco viene aggiunto ad un sistema di perfusione casereccio dove viene ri-ossigenato e riscaldato prima di raggiungere la camera di registrazione di interfaccia per gravità (Figura 1A). La camera di registrazione di interfaccia è stato progettato da FST (Belle Strumenti Scienza, Vancouver, Canada, figura 1b). Fette di tessuto sono posti su filtro di rete tessuta applicato all'anello ben rimovibile e può essere costantemente mantenuta in condizioni di interfaccia regolando l'altezza di aspirazione ben dell'ago. Un tubo di plastica fatta in casa bloccata alla sua estremità e forati lateralmente (0,5 mm) è fissato l'ago di aspirazione per aumentare la stabilità livello nella camera. La testina di registrazione è montata su un bagno d'acqua contenente una pietra dispersione gas che aiuta a mantenere un ambiente umido facendo passare aria umida attraverso i porti deflessione della testa di registrazione (per diminuire la formazione di goccioline d'acqua). Bagno e media temperatura sono controllati dal continuo variando il livello di secolo corrente continuaruvida una gomma siliconica-embedded elemento riscaldatore nel bagno d'acqua. Termistori nel bagno d'acqua e pozzi di registrazione consentono la temperatura della camera per impostare e monitorare con precisione in questi siti.

Il sistema di riscaldamento della camera è completata da un sistema di riscaldamento globale controllando la temperatura dell'intero impianto. Il software sviluppato dai ricercatori dell'Università di Edimburgo ( www.etcsystem.com ) monitora e equalizza la temperatura dell'aria ossigenata, la fetta cervello, gli elettrodi e l'impianto di perforazione restante fornire un ambiente stabile per registrazioni a lungo termine (Figura 1C) . La temperatura usato per topo fettine ippocampali è di 28 ° C.

  1. Risciacquare tutto il circuito di perfusione con H 2 O distillata per almeno 20 min e avviare i sistemi di riscaldamento.
  2. Avviare il gorgogliare CARBOGEN nel circuito. Carbogen arriva nei fatti in casa-tubi perfusione attraverso fcandele ilter e nel bagno d'acqua al di sotto della camera di registrazione. La portata nel bagno d'acqua è controllata da un flussometro. Se la portata è troppo lento, il tessuto potrebbe diventare ipossico. Viceversa, se la portata è troppo alta, il gas potrebbe non essere sufficientemente riscaldata e idratata conseguente essiccamento del tessuto. Elevata portata di gas potrebbe aumentare la probabilità di spruzzi d'acqua sul tessuto dal bagno d'acqua sottostante che porta a shock osmotico. Ciò può essere evitato aggiungendo pezzetti di maglia di nylon (100 pm) all'uscita dei porti deflessione.
  3. Svuotare il circuito e riempire con ACSF filtrata.
  4. Mettere l'anello che sosterrà la fetta nella camera di tenuta. Un filtro a rete tessuto con aperture di maglia che vanno 500-750 micron è allungata e collegata all'anello con colla epossidica resina a due componenti. Il filtro a rete tessuto è fatto di 87% poliammide e 13% elastan (collant 15 den). Colla deve essere applicata con attenzione per evitare la formazione di rilievi sulla superficie del ring.
  5. Rimuovere con attenzione tutte le bolle d'aria dal circuito.
  6. Regolare il livello di ACSF nella camera di registrazione con la vite dell'ago di aspirazione. La velocità delle pompe peristaltiche viene regolata a 1 ml / min per la pompa di aspirazione e di 5 ml / min per la pompa di scarico.

Il sistema di perfusione è posto su un tavolo resistente alle vibrazioni rigido e circondato da una gabbia di Faraday.

3. Preparazione della Zona Dissection

Strumenti chirurgici: un bisturi con lama # 11, piccole forbici standard di dissezione, forbici a molla, pinze curve, due Heidemann spatole e un cucchiaio.

Materiale supplementare: una ghigliottina, un underpad, un chopper tessuto McIlwain con una lama di rasoio, carta da filtro, una pipetta Pasteur di vetro con una tettarella di gomma, plastica 2 pipette Pasteur di cui uno con una bocca larga, una capsula di Petri, un cilindro metallico di 7 mm di diametro (Figura 2A).

  1. Nel piatto dissezione pieno di freddo ACSF (preparata nella fase 1), immergere un coperchio in vetro refrigerata da un piatto di colorazione, avvolto in carta da filtro. Rimuovere con attenzione le bolle d'aria e ossigenare il ACSF attraverso un acquario gorgogliatore (Figura 2A).
  2. Disporre di strumenti in ordine di utilizzo. Aggiungere tre strati di carta filtro sulla piastra chopper tessuto e una nuova lama di rasoio pulito con acqua distillata ed etere (Figura 2B). La lama deve essere orizzontale quando tocca la carta. Forza della lama viene regolata a metà del valore massimo e la velocità a circa un terzo del valore massimo.
  3. Verificare attentamente se tutto è pronto (strumenti, temperatura ...), perché non avrete tempo dopo.
  4. Chiedere a qualcuno di spruzzare la dissezione con una pipetta Pasteur pieno di ACSF freddo.
  5. Anestetizzare il mouse con IP Nembutal (100 mg / kg) prima di decapitazione. Alotano può anche essere usato. Abbiamo confrontato entrambi i metodi e obtained stessi risultati. Decapitazione deve essere eseguita in anestesia dislocazione cervicale ma può anche essere usato. Tuttavia dislocazione cervicale necessita di una pratica molto buona per evitare la sofferenza degli animali.
  6. Sezionare il underpad il più rapidamente possibile sotto doccia fredda continua ACSF.

4. Rimozione Cervello

  1. Mentre si tiene ancora la testa con il dito indice e il pollice di una mano sul muso, fare un'incisione con le forbici dissezione lungo la metà della parte superiore della testa a partire dal bordo del taglio ghigliottina e funzionante rostralmente all'osso frontale .
  2. Tagliare attraverso il muscolo cutaneo su ciascun lato della testa per esporre completamente le piastre cranio e rimuovere i muscoli a lato caudale della testa.
  3. Con le forbici dissezione, tagliare il muscolo temporale su ogni lato, lungo la piastra temporale, quindi tagliare le piastre frontali in mezzo, trasversalmente. Poi, fare un piccolo taglio sull'osso occipitale, tra i due plAtes.
  4. Per ogni lato, tagliato alla base caudale delle piastre occipitali.
  5. Tagliare lungo la sutura sagittale con le forbici a molla.
  6. Con una pinza, togliere le due metà del cranio, diffondendo loro distanti.
  7. Con il bisturi, tagliare trasversalmente appena dopo il bulbo olfattivo e poco prima del cervelletto poi precipitare il cervello estratto nel piatto dissezione con freddo ACSF.

5. Dissezione ippocampale

  1. Una volta che il cervello è immerso nel piatto dissezione, recidere i due emisferi uno dall'altro con un bisturi inserito nella metà.
  2. La dissezione di ippocampo viene eseguita con spatole sotto controllo visivo attraverso un microscopio binoculare chirurgico (X25, Figura 2A). Su un emisfero, accuratamente diffondere le strutture di vedere il ventricolo laterale. Rimuovere il tronco cerebrale e diencefalo. Questo viene fatto applicando il spatole sulla corteccia frontale su un lato e sul diencefalo suldall'altro lato. Fare attenzione a non toccare l'ippocampo con spatole e per non allungare durante il sezionamento dei tessuti.
  3. Sever del fornice quindi spingere delicatamente l'ippocampo fuori della corteccia (rotolare via), con l'inserimento di una spatola nel ventricolo.
  4. Quando l'ippocampo viene estratta, rimuovere il tessuto in eccesso e corteccia rimanenti vasi sanguigni.

6. Tagliare delle fette

  1. Con una bocca di plastica pipetta Pasteur, trasferire l'ippocampo in un cucchiaio, con le sue Alvear verso l'alto di superficie (lato convesso).
  2. Rimuovere il liquido in eccesso con uno standard di plastica pipetta Pasteur.
  3. Suggerimento il cucchiaio verticalmente quasi a toccare la carta da filtro del chopper (Figura 2B) e scendere l'ippocampo dal cucchiaio, dal rapido toccando la carta da filtro quindi spostare indietro il cucchiaio.
  4. Orientare l'ippocampo e tagliatelo a fette trasversalmente a 400 micron con l'elicottero (vedi Figura 2C per l'orientamento dell'ippocampopus relativi alla lama di rasoio). Agire il più rapidamente possibile.
  5. Rimuovere la carta da filtro con l'ippocampo a fette e avvolgerla intorno al cilindro metallico per diffondere le fette un po '. Poi, libera le fette con spruzzi di ACSF utilizzando una plastica standard di pipetta Pasteur e raccoglierli in una capsula di Petri riempita con ACSF freddo.

7. L'incubazione delle fette di interfaccia

  1. Selezionare fette con uno standard di plastica pipetta Pasteur e rapidamente metterli nella camera di registrazione. Fette riprendersi dal trauma dissezione direttamente nella camera di registrazione, in un'interfaccia a 28 ° C.
  2. La fetta molto probabilmente lavandino. Abbassare il livello del liquido di raggiungere il livello di sezione, e poi sollevarlo per farlo galleggiare.
  3. Ruotare la fetta nella posizione corretta mentre abbassando il livello. Fette sono sempre orientati nello stesso modo per facilitare il posizionamento di elettrodi (2 stimolante e uno elettrodi di registrazione) nella regione CA1.
  4. Fermarsi quandoil fluido è in interfaccia. A "menisco" dei media intorno alla fetta è indicativo di un livello sufficiente di supporti. Il filtro di rete deve essere saturo di media, ma non completamente sommerso.
  5. Tenere la camera coperta con carta da filtro posto sopra il coperchio forato.
  6. Lasciare riposare la fetta per almeno 1,5 ore a 28 ° C.

8. Registrazione delle risposte sinaptiche

  1. Registrazione di elettrodo: vetro capillari sono tirati da ottenere una resistenza punta di 2-5 MW quando è riempita di ACSF. Un piccolo pezzo di carta da filtro è disposto intorno alla punta dell'elettrodo e cera ossea è applicato all'estremità da ridurre la condensazione. Elettrodi stimolanti: platino-iridio elettrodi bipolari a grappolo con un diametro di 12,5 micron sono acquistati da FHC (USA). Con una cura, ciascun elettrodo può essere usato almeno 30 volte (Figura 1B).
  2. Posizionare gli elettrodi nella radiatum strato della regione CA1, tutti gli elettrodi rivestitiup (Figura 3A). Elettrodi vengono abbassati 75 a 150 micron sotto la superficie della fetta con Narishige micromanipolatori. I due elettrodi di stimolazione sono posti a stimolare due fasci distinti di Schaffer collaterali. Quando gli elettrodi vengono abbassati sulla fetta, carte da filtro sono accuratamente messi tutti intorno a chiudere la camera.
  3. Stimolazione bifasica (0,08 msec durata dell'impulso per mezza onda) viene eseguita a tensione costante con uno stimolatore Grass collegato a unità di isolamento SIU-V. Massima risposta è controllato aumentando l'intensità dello stimolo da 2 V a 12 V. massimo EPSPs di campo sono amplificati 1.000 volte con un amplificatore WPI ISO-80 e filtrati a 10 Hz e 10 kHz. Il segnale viene poi inviato ad un PC tramite uno strumento nazionale di un convertitore A / D. Stimolazione, l'acquisizione e l'analisi dei dati vengono eseguite utilizzando il programma WinLTP ( www.winltp.com ). EPSPs di campo sono registrate al 40% dell'ampiezza massima ottenuta in un ingresso-outmettere curva. Per ogni sezione, le piste fEPSP sono normalizzati contro la pendenza media del 30 min precede LTP induzione.
  4. LTP è innescato applicando un singolo treno di stimolazione (100 Hz) alla concentrazione di prova su una via mentre il secondo percorso serve da controllo.

9. Pulizia del Setup

  1. Sciacquare tutto il circuito con una soluzione al 3% di acqua ossigenata (H 2 O 2) per almeno 10 minuti, poi scolare. Il circuito sarà accuratamente risciacquati con acqua distillata prima di iniziare qualsiasi esperimento. L'uso di H 2 O 2 non è assolutamente necessaria come altri laboratori utilizzano solo acqua distillata per pulizia ma abbiamo notato la deposizione di residui scuri nel sistema di tubazioni utilizzando solo acqua.
  2. Sostituire l'acqua nel bagno d'acqua sotto la camera di registrazione.
  3. Bath gli elettrodi stimolanti suggerimenti in alcool per 5 min.

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Risultati

Questa metodologia è stata utilizzata per analizzare le proprietà di potenziamento a lunga durata a lungo termine indotta in fettine ippocampali acute da adulti topi C57BL/6J (JANVIER SAS, Francia) 14. Sorprendentemente, il miglioramento delle condizioni sperimentali ha portato ad un nuovo modo di guardare alla LTP. Abbiamo dimostrato che la crescita di lunga durata in forza sinaptica non ha richiesto la sintesi di nuove proteine.

Qui, dimostriamo che l'induzione LTP dipende f...

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Discussione

Abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio un protocollo risultante dalla combinazione dei metodi sviluppati e utilizzati da altri laboratori aventi un grande esperienza in registrazioni LTP 11,17. Questo protocollo è atto ad adulto ippocampo mouse e può essere utilizzato in animali di qualsiasi età e qualsiasi sfondo genotipo. Esso permette anche l'analisi LTP in topi transgenici sviluppare malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer 18,19.

L'utilizzo ...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Ringraziamo Bernard Foucart per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo belga per la Ricerca Scientifica (FRS-FNRS) e dal Fondo regina Elisabetta per la ricerca medica. Agnès Villers è assegnista di ricerca presso il Fondo belga per la Ricerca Scientifica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagent/Material
NaClSigma - AldrichS7653
NaHCO3Sigma - AldrichS8875
KClSigma - AldrichP9333
D-glucosioSigma - AldrichG7528
NaH2PO4 Sigma - AldrichS9638
MgSO4 1MSigma - Aldrich63126
CaCl2Sigma - AldrichC4901
CarbogenAir Liquide (Belgio)
CapillariWPI, Inc. (Regno Unito)TW150-4
Elettrodi stimolantiFHC (USA)CE2B30
Strumenti chirurgiciFST (Germania)
Carta da filtro 84 g/m2SartoriusFT-3-105-110
MeshLycra15 den
CollaUHUplus endfest300
Instrument
AmplifierWPI, Inc. (UK)ISO-80
Interfaccia camera di registrazioneFST (Germania)
Pompe peristalticheGilson (USA)Minipuls 3
Regolatore di temperaturaUniversità di Edimburgowww.etcsystem.com
TritatuttoMcllwain
StimolatoriGrass (USA)S88X + SIU-V
Analisi del programmaWinLTPwww.winltp.com
MicromanipolatoriNarishigeMM-3 e MMO-220A
Microscopio operatorioConvertitore A/D Leica Microsystem
National InstrumentsNIPCI-6229 serie
M

Riferimenti

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