Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

Summary

Cellule neuroprogenitor umane (NPC) sono stati ampliati in condizioni proliferanti. NPC sono stati differenziati in colture ricche di neuroni in presenza di una combinazione di neurotrofine. Marcatori neuronali sono state rilevate mediante immunofluorescenza. Per isolare una popolazione pura di neuroni, NPC sono stati differenziati sulla penna scivoli di membrana e cattura microdissezione laser è stata eseguita.

Abstract

Cellule Neuroprogenitor (NPC) isolati dal cervello fetale umano sono stati espansi in condizioni proliferative in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) per fornire un rifornimento abbondante di cellule. NPC sono state differenziate in presenza di una nuova combinazione di fattore di crescita nervosa (NGF), cervello-derivato fattore neurotrofico (BDNF), dibutirril cAMP (DBC) e acido retinoico su piatti rivestito con poli-L-lisina e mouse laminina per ottenere neurone -ricche culture. NPC sono stati differenziati anche in assenza di neurotrofine, DBC e acido retinoico e in presenza di fattore neurotrofico ciliare (CNTF) per produrre colture ricche di astrociti. NPC dissociati sono stati caratterizzati da immunofluorescenza per un pannello di marcatori neuronali tra cui NeuN, synapsin, acetilcolinesterasi, synaptophysin e GAP43. Proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) e STAT3, marcatori astrociti, sono stati rilevati nel 10-15% dei NPC differenziati. Per facilitaretipo cellulare caratterizzazione molecolare specifico, cattura microdissezione laser è stata eseguita per isolare neuroni coltivati ​​su polietilennaftalato (PEN) scorre membrana. I metodi descritti in questo studio forniscono strumenti preziosi per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari della neurodegenerazione.

Introduction

Vita lunga neurogenesi si verifica nella zona subventricular dei ventricoli laterali e nello strato subgranulare del giro dentato dell'adulto cervello dei mammiferi ^1. Cellule Neuroprogenitor (NPC) che provengono da queste regioni sono cellule multipotenti che possono differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti ^2. NPC hanno generato interesse a causa del loro potenziale per essere trapiantate nei pazienti affetti da varie patologie neurodegenerative tra cui il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, ictus e malattie (AD) ³ di Alzheimer. Studi con NPC sono generalmente concentrati su questo angolo trapianto....

Protocol

1. Ampliamento della NPC umani (Figura 1)

1. Revive lo stock congelati di NPC umani da cervello fetale (Lonza, Walkersville, MD, USA) e la cultura in sospensione in T-75 palloni come neurosfere (Figura 1A) in mezzo Neurobasal contenenti integratori proliferazione, EGF (10 ng / ml) e FGF (10 ng / ml).
2. Dopo 3 giorni di coltura, trasferire le neurosfere una provetta da 15 ml e centrifugare a 500 rpm per 5 min.
3. Eliminare il supernatante lasciando dietro ~ 100 microlitri di media sopra il pellet cellulare e trasferire in una provetta Eppendorf. Un pellet 100 microlitri di cellule è sufficiente per dividere in 2....

Results

Ampliamento della NPC (Figura 1)

Quando neurosfere sono ripartiti per una singola sospensione cellulare da triturazione, la punta della pipetta deve toccare il fondo della provetta in modo che vi sia una certa resistenza quando la sospensione è pipettati su e giù. Il numero di volte di triturazione può variare tra individui e deve essere decisa per tentativi ed errori esaminando la sospensione cellulare risultante sotto un microscopio. È importante fornire sufficiente densità d.......

Discussion

Descriviamo in questo studio un ricco di neurone modello di coltura cellulare per la differenziazione delle cellule autorinnovanti neuroprogenitor umani e un metodo per isolare una popolazione pura di neuroni cattura microdissezione laser. Abbiamo utilizzato una combinazione di NGF, BDNF, DBC e acido retinoico per la differenziazione neuronale di NPC. DBC viene utilizzato per attivare CREB, un fattore di trascrizione che migliora neurogenesi ^12. L'acido retinoico induce uscita dal ciclo cellulare e riduce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellule neuroprogenitrici (NPC)	Lonza	PT-2599
Neurocult NS-A Medium basale umano	Tecnologia delle cellule staminali	5750
Neurocult NS-A Integratore per la proliferazione	Tecnologia delle cellule staminali	5753
Neurocult NS-A Integratore per la differenziazione	Tecnologia delle cellule staminali	5754
Integratore B-27 (50x)	Invitrogen	17504-044
Fattore di crescita epidermico umano	Tecnologia delle cellule staminali	2633
Fattore di crescita dei fibroblasti	Sigma	F0291
Fattore neurotrofico derivato dal cervello	Segnalazione cellulare	3897S
Fattore di crescita nervoso	Invitrogen	13257-019
Dibutirrile ciclico AMP	Sigma	D-0627
poli-L-lisina	Sigma	P-5899
Lamina di topo	Sigma	L-2020
Acido retinoico	Anticorpo Sigma	R-2625
STAT3	Segnalazione cellulare	9132
GFAP Anticorpo	Segnalazione cellulare	3670
GAP43 Laboratori	di trasduzione	degli
Anticorpo BDNF	Millipore	AB1534SP
Anticorpo acetil colinesterasi	Santz cruz	Sc-11409
Anticorpo sinaptofisina	Abcam	ab18008-50
Anticorpo NeuN	Chemicon	MAB377
Anticorpo sinapsina	Novus	NB300-104
Anti topo FITC	Jackson Immuno	115-095-146
	Laboratori
Anti Rabbit Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Laboratori di
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Vetrino coprioggetti (vetrino coprioggetto per cerchi grandi)	Fisherbrand	12-545-102
Mezzo di montaggio (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
	Biosistemi applicati	LCM0521
Kit di colorazione della sezione congelata Histogene LCM	Biosistemi applicati	KIT0401
Kit di amplificazione dell'RNA RiboAmp	Biosistemi applicati	KIT0201
Kit di isolamento dell'RNA Picopure	Biosistemi applicati	KIT0202
Capsure Macro LCM Tappi	biosistemi applicati	LCM0211