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1. Ampliamento della NPC umani (Figura 1)
- Revive lo stock congelati di NPC umani da cervello fetale (Lonza, Walkersville, MD, USA) e la cultura in sospensione in T-75 palloni come neurosfere (Figura 1A) in mezzo Neurobasal contenenti integratori proliferazione, EGF (10 ng / ml) e FGF (10 ng / ml).
- Dopo 3 giorni di coltura, trasferire le neurosfere una provetta da 15 ml e centrifugare a 500 rpm per 5 min.
- Eliminare il supernatante lasciando dietro ~ 100 microlitri di media sopra il pellet cellulare e trasferire in una provetta Eppendorf. Un pellet 100 microlitri di cellule è sufficiente per dividere in 2 T-75 palloni. Se meno, ridurre il numero di flaconi come cellule neuroprogenitor non riescono a proliferare se dividere sottile.
- Triturare il pellet con un microlitri punta 50x 200 mantenendo la punta 200 microlitri contro il fondo della provetta. Dividere la sospensione cellulare equamente in due parti e aggiungerli a 2 T-75 palloni (1-2 split), uno per continuareespansione e un altro per la differenziazione.
- Continuare la coltura delle cellule neuroprogenitor per l'espansione (primo pallone) cambiando il mezzo ogni 4-5 giorni fino a quando le neurosfere raggiungono la loro dimensione originale di 300-500 micron. Cambiare mezzo mediante centrifugazione (500 rpm; 5 min), scartare il vecchio medio e aggiungere nuovo mezzo.
2. Differenziazione dei NPC umano in un Neuron ricco Cultura (Figura 2)
- Per differenziazione delle cellule neuroprogenitor in una ricca cultura neurone, posizionare un singolo coprioggetto in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e cappotto con 100 ug / ml di poli-L-lisina aggiungendo 500 microlitri in ciascun pozzetto. Incubare i piatti per 30 minuti a RT.
- Aspirare la soluzione di poli-L-lisina e lavare la piastra con acqua sterile.
- Successivamente, cappotto pozzetti della piastra con 500 ml di 5 mcg / ml del mouse la laminina e incubare per 30 min. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti con PBS.
- 4 giorni dopo splitting le cellule (fase 1.4), trasferire i piccoli neurosfere nel pallone dicitura «differenziazione 'nei piatti rivestiti con una densità di ~ 500 neurosfere per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
- Dopo 6 ore, quando le neurosfere attribuiscono al piatto, rimuovere il terreno proliferazione e differenziazione aggiungere mezzo costituito da mezzo Neurobasal, B27 supplemento, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), e acido retinoico (2 mM).
3. Immunofluorescenza di dissociati NPC (Figura 3)
- Seguendo coltura di cellule neuroprogenitor in terreno di differenziamento neuronale per due settimane, si ottiene una ricca cultura-neurone. Risciacquare i neuroni una volta in PBS e poi fissare in paraformaldeide al 4% per 30 min. Una volta fissato, lavare le cellule tre volte con PBS.
- Incubare le cellule con tampone permeabilizzazione (5% BSA e 0,2% Triton X-100 in PBS) a temperatura ambiente per 60 min.
- Incubare le stoviglie O / N a 4 ° C ina shaker con la seguente combinazione di anticorpi policlonali e monoclonali nel 3% BSA in PBS: NeuN (1:250) e synapsin (1:250); acetil colinesterasi (1:500) e synaptophysin (1:250); BDNF (1 : 500) e GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) e GFAP (1:1.000).
- Lavare i coprioggetti tre volte con PBS e poi incubare con anti-coniglio-Cy3 e anticorpi secondari anti-topo-FITC a RT al buio per 90 min. Dopo l'incubazione, lavare i vetrini tre volte con PBS.
- Mettere 10 ml di mezzo di montaggio su un vetrino, estrarre il vetrino dalla piastra di coltura con una pinza, e metterlo a testa in giù sul supporto di montaggio. Delicatamente, spazzare via qualsiasi mezzo di montaggio in eccesso e sigillare i bordi con smalto.
- Esaminare i neuroni immunostained in un microscopio a fluorescenza.
4. Microdissezione laser di neuroni (Figura 4)
- Differenziare NPC in una cultura ricca di neuroni su PEN membrana diapositivas rivestite con poli-L-lisina e mouse laminina seguendo le procedure descritte per la Figura 2.
- Eseguire tutti i passaggi successivi in condizioni di RNasi-free.
- Macchiare le culture usando HistoGene Stain (Arcturus) per visualizzare le cellule.
- Trova le aree di popolazioni neuronali pure privi di astrociti utilizzando la mappa stradale immagine di tutto il vetrino con il sistema Veritas LCM. Marcare i neuroni utilizzando gli strumenti di disegno.
- Eseguire cattura laser di queste zone con precisione controllato da computer e automazione in un processo a due fasi. In primo luogo, IR (a raggi infrarossi) è sparato in più punti con un livello di potenza del laser di 70 mW e un impulso di 2.500 psec per ottenere la membrana allegare al tappo. Successivamente, la zona evidenziata viene asportato con un utensile da taglio UV a un livello basso livello di 10 mV.
- La combinazione di questi processi cattura selettivamente le aree contrassegnate dalla membrana PEN su CapSure LCM caps macro. Quando il tappo viene sollevato, la membrana con il neurons aderisce al cap.
- Isolare RNA totale da campioni LCM utilizzando un kit di isolamento PicoPure RNA (Arturo) e trattare con DNasi.
- Amplificare l'RNA isolato usando il kit di amplificazione RiboAMP RNA seguendo le istruzioni del kit.
- Eseguire in tempo reale RT-PCR usando sonde TaqMan per rilevare neurofilament umana catena pesante (hNFHc).
Abbreviazioni:
DC, il morbo di Alzheimer; BDNF, fattore neurotrofico cervello-derivato, CREB, ciclico elemento di risposta AMP proteina legante, DBC, dibutirril AMP ciclico, EGF, fattore di crescita epidermico, FGF, fattore di crescita dei fibroblasti, GFAP, proteina acidica fibrillare gliale, LCM, laser cattura microdissezione, NGF, fattore di crescita nervosa, NPC, neuroprogenitor cellulare, PEN, polietilennaftalato.