Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.
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Articolo metodologico
Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule umane non proliferano indefinitamente. Su indicazioni esterne e / o intrinseca, le cellule potrebbero morire o entrare in un arresto del ciclo cellulare stabile chiamato senescenza. Diversi meccanismi cellulari, come accorciamento dei telomeri e anormale espressione di oncogeni mitogeni, hanno dimostrato di causare senescenza. La senescenza non è limitato alle cellule normali, sono state riportate anche le cellule tumorali a senesce.
Farmaci chemioterapici hanno dimostrato di indurre la senescenza nelle cellule tumorali. Tuttavia, resta controverso se la senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi. Come potrebbe eventualmente essere paziente-specifico, sarà presto necessario un metodo rapido e sensibile per valutare senescenza in cellule di cancro.
A tal fine, il saggio β-galattosidasi standard, il metodo attualmente utilizzato, presenta notevoli svantaggi: è tempo e non è sensibile. Proponiamo qui un saggio di citometria a base di flusso per studiare senescenza su Live cellule. Questo saggio offre il vantaggio di essere rapida, sensibile, e può essere accoppiato al immunomarcatura dei diversi marcatori cellulari.
Introduzione
Poiché primi anni Sessanta e la sua scoperta da Hayflick e Moorhead, senescenza rimane una curiosità cellulare 1. Le cellule umane non proliferano indefinitamente e, da senescenza, Hayflick e Moorhead coniato il processo di invecchiamento cellulare. Senescenza è un arresto del ciclo cellulare stabile in cui le cellule rimangono metabolicamente attive in contrapposizione alla morte cellulare. Ad oggi, quattro meccanismi cellulari hanno mostrato di indurre senescenza: telomeri, danno al DNA, cromatina perturbazione, e anormale espressione di oncogeni mitogenico 2. Ciò indica che non solo le cellule normali, ma anche le cellule tumorali sono in gra....
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Protocollo
1. Preparazione di C12FDG, bafilomicina A1, e Cell Culture
- Sciogliere la polvere C 12 FDG in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 20 mM. Aliquota e conservare a -20 ° C. DMSO deve essere usato con adeguate condizioni di sicurezza.
- Sciogliere la bafilomicina A1 polvere in DMSO ad una concentrazione finale di 0,1 mM. Aliquota e conservare a - 20 ° C. Bafilomicina deve essere usato con adeguate condizioni di sicurezza.
- Coltivare RPMI 8226 linea cellulare, o altre linee cellulari aderenti o meno, in terreni contenenti 10% di siero fetale bovino e antibiotici 1%, a 37 ° C, 5% di CO 2. Stimare il nume....
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Risultati
Mieloma multiplo, un tumore ematologico, è stato utilizzato per valutare la senescenza indotta da una procedura di chemioterapici. Per fare così un linea cellulare MM commercialmente disponibile (RPMI 8226) è stato trattato per 2 giorni con doxorubicina, un farmaco chemioterapico. Le cellule sono state poi sottoposte a trattamento bafilomicina A1 e ulteriormente incubati con C 12 FDG. Le cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. Figura 1 illustra le diverse fasi e mostra ch.......
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Discussione
Abbiamo presentato qui un metodo di citometria a base di flusso per quantificare la senescenza cellulare in cellule tumorali dal vivo. Questo metodo si basa sull'uso del composto membrana permeabile, il C 12 FDG, e può quindi essere utilizzato in qualsiasi tipi cellulari e dopo vari trattamenti finché il composto viene assorbito dalle cellule. Dopo l'assorbimento cellulare, il C 12 FDG viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, arricchito nei lisosomi delle cellule senescenti. Dopo eccitazion.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il SF 4206 ICORE (Université de Caen) per l'utilizzo della struttura di citometria. JC ha ricevuto borse di studio post-dottorato dal Conseil de Radioprotezione d'EDF e Conseil Régional della Bassa Normandia. Tali dati erano parte di progetti finanziati dalla Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galattopiranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimetil solfossido | Sigma | D2650 | |
| Bafilomicina A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicina | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 terreno di coltura cellulare | Lonza | BE12-702 | |
| Siero fetale di vitello | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotici | Gibco | 5290-018 | |
| Citometro a flusso | Gallios Beckman Coulter | A94291 |
Riferimenti
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biolo....
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Ristampe e permessi
