Articolo metodologico

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte

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DOI:

10.3791/50513

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4 luglio 2013

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1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

In questo articolo

Sommario

Qui si descrive un protocollo per optogenetic manipolazione delle attività dei motoneuroni, mentre il monitoraggio dei cambiamenti in uscita del motore (contrazione muscolare) in semi-intatte Drosophila Larve utilizzando laser all'interno di un microscopio confocale convenzionale. Questa tecnica consente ai ricercatori di ottenere perturbazione locale dell'attività neurale in pochi neuromeres per chiarire la dinamica di circuiti motore.

Abstract

Drosophila larvale locomozione è un sistema modello splendido in sviluppo e fisiologici delle neuroscienze, in virtù della accessibilità genetica dei componenti neuronali sottostanti nei circuiti 1-6. Applicazione di optogenetics 7,8 nel circuito neurale larvale ci permette di manipolare l'attività neuronale in modi e nello spazio fantasia 9-13. Tipicamente, i campioni sono ampiamente illuminate con una lampada a mercurio o LED, così specificità dei neuroni bersaglio è controllata da sistemi di espressione genica binarie come il sistema GAL4-UAS 14,15. In questo lavoro, per migliorare la risoluzione spaziale di "risoluzione sub-genetica", abbiamo illuminato localmente un sottoinsieme di neuroni nel cordone nervoso ventrale utilizzando laser implementati in un microscopio confocale convenzionale. Monitorando il movimento della parete del corpo delle larve semi-intatte, abbiamo interattivamente attivato o inibito l'attività neurale con channelrhodopsin 16,17 Or halorhodopsin 18-20, rispettivamente. Da spazialmente e temporalmente illuminazione ristretta del tessuto neurale, possiamo manipolare l'attività dei neuroni specifici nel circuito ad una specifica fase di comportamento. Questo metodo è utile per studiare il rapporto tra le attività di un gruppo neurale locale nel cordone nervoso ventrale e il pattern spazio-temporale di uscita del motore.

Introduzione

Locomozione avanti peristaltica in larve di Drosophila avviene per la propagazione della contrazione muscolare da posteriore a segmenti anteriori. Questo movimento è realizzato da attivazione sequenziale di motoneuroni all'interno del cordone nervoso ventrale lungo l'asse longitudinale del corpo. Per esaminare il circuito dietro a questa attività di moltiplicazione di fantasia, perturbazione locale di attività neurale potrebbe essere un approccio informativo. Sebbene saggio farmacologico può controllare sostanza specifica, come neurotrasmettitori, in tessuto neurale, l'effetto dei farmaci farmacologici può essere simile tra quasi tutti i segmenti perché il cordone nervoso ventrale larvale struttura ripetitiva è composta neuromeres simili lungo l'asse longitudinale. Alternativamente, si potrebbe esprimere optogenetic o molecole sonda termosensibili in un piccolo numero di segmenti. Tuttavia, tali specifiche GAL4 linee sono molto difficili da generare. Qui vi presentiamo un metodo per manipolare i neuroni in alcuni segmentimenti che utilizzano illuminazione laser. Approfittando della illuminazione spazialmente confinate in microscopia confocale, si può perturbare l'attività dei neuroni in un'area locale. Combinata con il modello di espressione della sonda di sottoinsiemi di neurone-specifici GAL4 linee, questo metodo di illuminazione laser migliora notevolmente risoluzione spaziale per perturbazione. E poiché questo metodo richiede solo un microscopio confocale convenzionale, l'acquisto di attrezzature di laboratorio supplementare non è in genere necessario.

Usando questa tecnica, abbiamo esaminato il ruolo dell'attività neuronale motore durante la propagazione di uscita del motore 13. Bloccando le attività dei motoneuroni entro pochi segmenti durante il movimento peristaltico, siamo stati in grado di verificare se l'attività dei motoneuroni stessi è necessaria per la propagazione del segnale di uscita del motore. Blocco locale e transitoria dei motoneuroni arrestato la propagazione del movimento peristaltico. Dopo che il blocco è stato rimosso, propagation apparso al segmento in cui l'onda era stato arrestato. Questo fenomeno suggerisce che senza attivazione neuronale motoria, l'onda di propagazione non può progredire lungo il cordone nervoso ventrale ulteriormente, e quindi l'attivazione dei neuroni motore è necessaria per il movimento peristaltico. Abbiamo precedentemente riportato dati dettagliati e discussioni su questo fenomeno in Inada et al. (2011) 13. Qui, descriviamo il metodo per perturbare attività neurale interattivamente durante il monitoraggio del movimento delle larve sezionato. Utilizzando varie Gal4 linee e serie di modelli spazio-temporali per la manipolazione di attività, si può indagare la logica circuiti attraverso proprietà di risposta perturbazione del circuito del motore.

Protocollo

1. Larve di preparazione

  1. Mantenere volare linee di ok6-Gal4, UAS-ChR2 o ok6-Gal4, UAS-NpHR2 in flaconi di plastica contenenti cibo volare standard.
  2. Diffusione lievito pasta contenente tutto-trans retinico (ATR) a concentrazioni appropriate (1 mm per ChR2, 10 mm per NpHR2 ("NpHR" in breve) su una piastra di agar succo di mela.
  3. Pick up 2 ° o 3 ° instar larve dai flaconi e metterli sul piatto ATR-contenente.
  4. Li allevare a 25 ° C al buio per un appropriato periodo di tempo (1 giorno per ChR2, 2 giorni per NpHR.)

2. Setup Microscopio

  1. Collegare una telecamera CCD (XCD-V60, Sony) ad un microscopio confocale convenzionale (nel nostro caso, FV1000, Olympus) con attacco C-Mount (ingrandimento 0.35x).
  2. Se vi è un otturatore lungo il percorso della luce dalla lente obiettivo alla telecamera CCD, che si chiude durante la scansione laser, rimuoverlo con cautela. Come questo passaggio dipende dalla microsgestire la configurazione, contattare il produttore del microscopio per il supporto tecnico, se necessario.

3. Dissection

  1. Risciacquare le larve ATR-fed con acqua per rimuovere residui di cibo dal corpo.
  2. Mettere la larva su un piatto rivestito sylgard, lato dorsale alto (il lato dorsale ha due tubi tracheali esecuzione longitudinalmente, uno ciascun lato della linea mediana dorsale). Lo spessore del sylgard è circa 5mm.
  3. Inserire un perno di insetto (Austerlitz perni insetti, Φ0.10mm, acciaio) nella coda tra i tubi tracheali con una pinza (# 5 Inox, FST da Dumont, Svizzera). I perni, circa 10mm lunghi, devono essere piegate o tagliate per essere abbastanza breve (~ 2 millimetri lunga) per evitare di colpire e danneggiare la superficie della lente obiettivo. Poi mettere il secondo perno insetto nella testa della larva vicino alla bocca del gancio, nero Struttura artiglio all'estremità anteriore.
  4. Aggiungi Ca 2 + senza soluzione fisiologica (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mm, HEPES-NaOH 5 mM,Saccarosio 36 mm (pH7.1)) per mantenere la larva umido.
  5. Fai una piccola incisione vicino alla coda con micro forbici (MB-50-7, Napox, Giappone).
  6. Dall'incisione, fare un taglio longitudinale lungo la linea mediana dorsale verso la testa. Fare attenzione a non danneggiare il cordone nervoso ventrale (VNC) e assoni.
  7. Fai una piccola incisione alla testa lateralmente.
  8. Mettere 4 perni ad ogni angolo della bodywall sezionato. La parete del corpo dovrebbe essere allungata sufficiente per visualizzare un modello segmentale della parete del corpo, ma non troppo per ostacolare movimento peristaltico.
  9. Rimuovere gli organi interni tranne il cervello e la VNC e sciacquare il campione con Ca 2 + senza soluzione fisiologica.
  10. Regolare l'orientamento del cordone nervoso ventrale essere bilateralmente simmetrica modificando la posizione e l'orientamento dei perni insetti sulle parete del corpo. Per fissare la posizione del cordone nervoso ventrale, inserire un ago attraverso il tessuto tra il cervello e la bocca agganciare giù al sylgard.
  11. Sostituire il tampone con 2 mM Ca 2 + Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, saccarosio 36 mm (pH7.3)).

4. Imaging con laser illuminazione

  1. Fissare un obiettivo obiettivo secco 4x (UPlanSApo 4x, NA 0,16, Olympus, Giappone) nel microscopio confocale e impostare la preparazione larva sul palco.
  2. Ottenere un'immagine trasmissione della preparazione sezionato con un laser rosso (633nm) per individuare il cordone nervoso ventrale da microscopio confocale. Per questo la scansione, accertarsi di non utilizzare un laser di 488nm o 559nm, che induce una stimolazione indesiderata di ChR2 o NpHR, rispettivamente.
  3. Definire la regione di interesse (ROI) l'immagine in trasmissione. Modalità zoom potrebbe essere utile per la determinazione dettagliata del ROI.
  4. Modificare il set di filtri del microscopio di illuminare con la luce 488nm o 559nm.
  5. Illuminare la preparazione con una lampada alogena per visualizzare la parete del corpo. Thpreparazione e può essere controllato con una telecamera CCD collegata al microscopio confocale.
  6. Registrare il movimento della parete del corpo e passare il raggio laser e disattivata durante il monitoraggio del movimento.

Risultati

Attivazione locale e transitoria dei motoneuroni con ChR2.

Abbiamo espresso ChR2 nei motoneuroni. Gli assoni dei neuroni motori emergono da ciascun segmento progetto VNC ad un corrispondente segmento della parete del corpo. Quando abbiamo stimolato una o due segmenti del VNC con un laser blu, muscoli nei segmenti corrispondenti esposte contrazioni (Figura 1).

Inibizione locale e transitoria dei motoneuroni con NpHR.

Abbiamo espresso NpHR nei motoneuroni. Quando abbiamo stimolato qualche (1 ~ 2) segmenti di VNC con un laser giallo durante le contrazioni muscolari peristaltiche, l'onda di propagazione è stato arrestato presso i corrispondenti segmenti della parete del corpo (Figura 2). Poi l'onda riavviato dai segmenti arrestati quando abbiamo spento l'illuminazione laser 13.

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Figura 1. Attivazione locale dei motoneuroni con ChR2. A. Schema di attivazione locale di preparazione in filetti. Con l'illuminazione blu-luce di alcuni segmenti del cordone nervoso ventrale esprimono ChR2 nei motoneuroni, muscoli nei corrispondenti segmenti sono contratte (testa di freccia). B. immagini trasmissione di una larva sezionato. Illuminazione locale del cordone nervoso ventrale (freccia teste) induce la contrazione segmentale dei muscoli della parete del corpo (frecce).

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Figura 2. Inibizione locale dei motoneuroni con NpHR. A. Schema di inibizione locale della preparazione in filetti. Di colore giallo-lilluminazione ight di alcuni segmenti del cordone nervoso ventrale esprimono NpHR nei motoneuroni, muscoli contrazione durante spontaneamente-verificato movimento peristaltico (testa di freccia in alto) sono rilassati (testa di freccia in basso.) B. immagini trasmissione di una larva sezionato . Illuminazione locale del cordone nervoso ventrale (punte di freccia) rilassato i segmenti della parete del corpo spontaneamente-contratto (frecce).

Discussione

Perturbazione temporale e locale di attività neurale è una tecnica preziosa per analizzare le dinamiche di rete dei circuiti neurali. In questo protocollo, vi presentiamo un metodo per manipolare l'attività neurale da optogenetics utilizzando un laser. Elevata direzionalità del laser permette una stimolazione optogenetic più localizzata di stimolazione campo largo con mercurio o una lampada allo xeno. Anche se illuminazioni laser sono già state applicate ai optogenetics in studi precedenti, configurazioni particolari come la fibra di vetro, micromanipolatore e sorgente laser, sono necessari studi più precedenti. In questo protocollo, usiamo un microscopio confocale convenzionale per l'illuminazione locale. Dal momento che il sistema di microscopia confocale è ampiamente usato, questo metodo si aprirà la possibilità di applicare optogenetics risoluzione più elevata in molti laboratori.

Il protocollo ha due punti critici: dissezione larvale e la potenza del laser. In primo luogo, se il cervello, il cordone nervoso ventrale o un nervo motore sono danneggiati duridissezione ng, le larve esporrà meno o movimento peristaltico spontanea. La precisione è quindi indispensabile, soprattutto quando si effettua una incisione sul lato dorsale con le forbici a molla e la rimozione degli organi interni con una pinza. Dettagli sulla dissezione sono stati riportati in precedenza 21. In secondo luogo, se la stimolazione è sufficiente da raggiungere, una potenza laser di circa 0,1 ~ 1 mW / mm 2 per ChR2 o 1 è richiesto ~ 10 mW / mm 2 per NpHR. Abbiamo valutato la potenza del laser come potenza luminosa totale sotto una lente obiettivo diviso per una superficie stimata di illuminazione. Abbiamo misurato la potenza totale della luce utilizzando un misuratore di potenza (Mobiken, Sanwa MI Technos, Giappone). Abbiamo stimato la zona di illuminazione come tempi costanti circolari il quadrato della lunghezza d'onda del laser, che dà approssimativamente area illuminata in limite di diffrazione. Effettiva potenza di illuminazione sul campione può essere regolata non solo dalla potenza di uscita del laser, ma anche modificando la velocità di scansione e insensibileer di ripetizioni. Abbiamo analizzato laser con 20-100 msec / pixel per 63 volte. Inoltre, il livello di espressione della proteina optogenetics e la quantità di ATR sono anche critico per l'efficienza stimolazione. Di conseguenza, se le larve non ha mostrato alcuna risposta optogenetic, i seguenti punti dovrebbero essere controllati e corretti: 1) potenza del laser (attraverso l'ottimizzazione del sistema microscopio), 2) livello di espressione della proteina optogenetics (controllando genotipo e temperatura di allevamento), e 3) quantità di ATR (regolando la concentrazione di ATR e periodo di alimentazione). NpHR richiede maggiore concentrazione di ATR di ChR2 fa da motivi sconosciuti 13. ChR2 funziona bene in larve allevate in alimenti contenenti meno ATR (ad esempio 0,1 mm) rispetto a qui descritto (1 mm). Come nutrire le larve di 1 mM ATR è sufficiente per rendere ChR2 foto-reattivo, si consiglia di questa concentrazione per la prima prova in ChR2 esperimenti. La concentrazione di ATR può successivamente essere titolato giù da 1 mM. Quanto alla durata dell'esposizione per ATR, si consiglia dila durata qui descritta per il controllo optogenetic robusto. Spesso non avrebbe osservato la risposta optogenetic durante l'alimentazione delle larve di ATR per la durata più breve.

In questo protocollo, illuminazione laser e l'acquisizione delle immagini sono gestite da un computer separato. Quindi, chiara individuazione del modello di spazio-temporale di illuminazione laser per telecamera CCD è fondamentale per l'analisi dei dati. Se il punto laser o la linea è scarsa immagine del CCD, si dovrebbe ottimizzare la potenza della lampada alogena e valore di guadagno della camera CCD per visualizzare l'illuminazione laser, mantenendo muro corpo visibile.

Illuminazione spazio-temporale mostrato in questo protocollo fornisce informazioni sui circuiti motore larvali, tuttavia, il metodo ha alcune limitazioni. Per quanto riguarda l'aspetto "spaziale", la posizione della illuminazione viene registrato immagine CCD a basso ingrandimento utilizzato per filmare i movimenti della parete del corpo di. Pertanto, area di illuminazione può essere assegnato a livello di segmento, ma non a livello cellulare. Quanto alla "temporal "aspetto, il tempo che intercorre tra l'accensione del laser a scansione al microscopio confocale e l'illuminazione con laser dipende dal sistema di microscopia confocale e la condizione di scansione. Pertanto, è necessario un po 'di prove per tentativi ed errori per regolare i tempi di illuminazione. Dal momento che i tempi di illuminazione può essere determinato in CCD film immagine utilizzando il software adeguato come ImageJ, il fattore critico nella risoluzione temporale è il frame rate della telecamera CCD imaging. Siamo in genere impostare il frame rate per 7,5-15 fotogrammi al secondo.

Advances in strumenti optogenetic ci offrono la possibilità di modificare il presente protocollo. Abbiamo usato 3 ° larve instar possesso ok6-Gal4 e UAS-ChR2 [H134R] o UAS-NpHR2. Altri strumenti optogenetic invece di ChR2 [H134R] o NpHR2 come ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 o Arch può aumentare l'efficienza del controllo di attività 22. Inoltre, utilizzando altri Gal4 linee o analizzare in altri stadi di sviluppo in grado di fornire ulteriori informazioni sul ciruito motorets.

In questo protocollo, attività motoria è stata monitorata mediante immagini di trasmissione della contrazione bodywall con una telecamera CCD. L'attività dei motoneuroni con molecole fluorescenti calcio-sensibili (ad es GCaMP) può anche essere monitorato direttamente durante la manipolazione attività neurale con ChR2 o NpHR. In questo caso, blu illuminazione luce in un'area ampia e una camera CCD altamente sensibile (es. telecamera EMCCD) sono utilizzati al posto di una lampada alogena e la camera CCD normale precedentemente descritto. Per migliorare la risoluzione spaziale di stimolazione mentre il monitoraggio bodywall movimento, utilizzando una lente obiettivo supplementare può essere un metodo più avanzato: illuminazione del cordone nervoso ventrale da una lente obiettivo alto ingrandimento (es 40x) da sopra il campione e monitoraggio bodywall partire da lente di ingrandimento (ad esempio 4x) sotto il campione. Questo sistema a doppia lente può permetterci di stimolare il sistema nervoso in maggiore risoluzione spaziale.

Il protocollo qui riportate può essere applicato ad altri circuiti neurali, forniti strumenti optogenetic possono essere espressi nel sistema nervoso e preparato in cui luce sufficiente può essere spedito nel tessuto neurale può essere stabilita.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica sulle aree innovative "Mesoscopic neurocircuitry" (n. 22.115.002) e "Comprehensive Cervello Network Science" (n. 221S0003) del Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza, e la tecnologia, il Giappone ad AN e Grant-in-Aid per giovani scienziati (B) (n. 21.700.344) della Società Giapponese per la Promozione della Scienza (JSP) a HK

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BX61WI MicroscopioOlympus CorporationBX61WI
Fluoview FV1000 sistema confocaleOlympus CorporationFV1000
CCD cameraSonyXCD-V60
all-trans retinaleSigmaR2500-500MG200 mM stock al 95% EtOH
Silpot184Dow Corning Toray3255981

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