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L'analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l'interazione proteina-proteina

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

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L'analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l'interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l'interazione proteina-proteina.

Abstract

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Tra i metodi per studiare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule, bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è relativamente semplice e sensibile. BiFC è basato sulla produzione di fluorescenza con due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente (Venere, una variante Proteina Fluorescente Giallo, è usato qui). Non fluorescenti frammenti Venus (VN e VC) sono fusi a due proteine ​​interagenti (in questo caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), cedendo fluorescenza dovuto all'interazione VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e la formazione di una proteina fluorescente funzionale all'interno delle cellule.

BiFC fornisce informazioni sulla localizzazione subcellulare di complessi proteici e la forza delle interazioni proteina basati sull'intensità di fluorescenza. Tuttavia, l'analisi BiFC utilizzando microscopia a quantificare la forza di interazione proteina-proteina è lunga e alquanto soggettiva causa di eterogeneità nell'espressione della proteina e di interazione. Con flusso citometria accoppiamentoanalisi con metodologia BiFC, il segnale di interazione proteina-proteina fluorescente BiFC può essere misurata con precisione per una grande quantità di cellule in breve tempo. Qui, dimostriamo una applicazione di questa metodologia per mappare le regioni in PDE4D3 che sono necessari per l'interazione con AKAP-Lbc. Questa metodologia throughput elevato può essere applicata a fattori di screening che regolano l'interazione proteina-proteina.

Introduction

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650.000 interazioni proteina-proteina sono stimati ad esistere nel interattoma umano, gioca un ruolo critico nel mantenimento della normale funzionalità delle cellule 1,2. Oltre co-immunoprecipitazione (co-IP), il gold standard per studiare l'interazione proteina-proteina dal lisato cellulare, parecchi frammenti proteici saggi di complementazione (PCA) sono stati sviluppati per migliorare la sensibilità nella rilevazione di interazione proteina-proteina all'interno delle cellule 3. Le tecniche includono Förster Resonance Energy Transfer (FRET), bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET), e bimolecular complementazione fluorescenza ....

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Protocol

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1. Trasfezione delle cellule

  1. Cellule piastra il giorno prima della transfezione, placcatura meno cellule per immunofluorescenza.
    1. Per immunofluorescenza: in un 6-pozzetti, cappotto di vetro coprioggetto (1 per bene) con il 0,02% di gelatina a 37 ° C per almeno 4 ore, lavare una volta con il mezzo, e per ogni bene, piastra 1 x 10 5 HEK 293T cellule in 2 ml di mezzo di crescita completo [mezzi di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) più 10% FBS].
    2. Per le analisi di citometria a flusso e Western Blot: piatto 1,2 x 10 5 HEK 293T cellule / pozzetto in 2 ml di terreno di coltura completo in 6 pozzetti (0,3 x 10 5 ....

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Results

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AKAP-Lbc e PDE4D3 costrutti (Figura 1B) sono state fuse a VN e frammenti VC, rispettivamente. Interazione di AKAP-Lbc e PDE4D3 risultati in funzionale YFP fluorescenza (Figura 1A). Qui usiamo il metodo BiFC per mappare i siti AKAP-LBC-vincolanti in PDE4D3. Regione a monte conservata 1 (UCR1), regione a monte conservato 2 (UCR2) e regione catalitica (CAT) sono conservati tra PDE4 proteine ​​della famiglia, quindi, tutta la lunghezza (FL), UCR1 e UCR2 più CAT sono stati utilizzati per lo .......

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Discussion

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BiFC è un metodo semplice e sensibile per studiare l'interazione proteina-proteina. Questo metodo non può essere usato per identificare nuove interazioni proteina-proteina, tuttavia, è particolarmente conveniente per confermare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule e per studiare le proprietà funzionali, quali localizzazione subcellulare dei complessi proteici, mappatura dei siti di interazione proteina-proteina, e per lo screening di piccole molecole / peptidi che possono modulare l'.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

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Ringraziamo il laboratorio O'Bryan a UIC per la valutazione sperimentale critica e discussione. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association Concessione 11SDG5230003 di GKC e National Center for Advancing Science Translational - Centro UIC per Scienze Cliniche e traslazionale sovvenzione UL1TR000050.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Dulbecco’ s Aquila modificata’ s media (DMEM)Invitrogen11965-092
Penicilina-Streptomicina (penna/streptococco), 100xInvitrogen15070-063
Siero fetale bovino (FBS)Invitrogen16000-044
Anticorpo anti-bandieraSigmaM2, F1804
Anticorpo anti-HACovance16B12, MMS-101R
α-tubulinaSigmaDM1A, T9026
Anticorpo anti-GFPClontech632569
Piastre per colture cellulari, coltura tissutale a 6 pozzetti trattataThermo Fisher Scientific130184
cellule HEK 293T ATCCCRL-11268
Kit di purificazione plasmidico Maxiprep, alta velocitàQiagen12663
Dulbecco’ s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS), sterile 1xInvitrogen14190-144
Tripsina-EDTA, 0,05% (p/v)Gibco25300
Provette in polistirene a fondo tondo per colorazione FACSBD Biosciences352052
ParaformaldeideFisher ScientificS74337MF
Reagente antisbiadimento all'oro prolungato con DAPIInvitrogenP-36931
Vetrini per microscopio Superfrost plusFisher Scientific12-550-15
Fisherfinest vetro di copertura premiumFisher Scientific12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed IncubatoreNuAIR DH autoflow
Microscopio confocale LSM510 METACarl Zeiss, Inc
Unità di trasferimento e elettroforesiBiorad
Cyan ADP Citometro a flussoBeckman Coulter

References

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  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. ....

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Protein Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationFlow CytometryFluorescence IntensityHigh Throughput ScreeningVenus Fluorescent ProteinWestern BlotSubcellular LocalizationTransfection MethodMean Fluorescence Intensity

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