L'analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l'interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l'interazione proteina-proteina.
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Articolo metodologico
L'analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l'interazione proteina-proteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tra i metodi per studiare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule, bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è relativamente semplice e sensibile. BiFC è basato sulla produzione di fluorescenza con due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente (Venere, una variante Proteina Fluorescente Giallo, è usato qui). Non fluorescenti frammenti Venus (VN e VC) sono fusi a due proteine interagenti (in questo caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), cedendo fluorescenza dovuto all'interazione VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e la formazione di una proteina fluorescente funzionale all'interno delle cellule.
BiFC fornisce informazioni sulla localizzazione subcellulare di complessi proteici e la forza delle interazioni proteina basati sull'intensità di fluorescenza. Tuttavia, l'analisi BiFC utilizzando microscopia a quantificare la forza di interazione proteina-proteina è lunga e alquanto soggettiva causa di eterogeneità nell'espressione della proteina e di interazione. Con flusso citometria accoppiamentoanalisi con metodologia BiFC, il segnale di interazione proteina-proteina fluorescente BiFC può essere misurata con precisione per una grande quantità di cellule in breve tempo. Qui, dimostriamo una applicazione di questa metodologia per mappare le regioni in PDE4D3 che sono necessari per l'interazione con AKAP-Lbc. Questa metodologia throughput elevato può essere applicata a fattori di screening che regolano l'interazione proteina-proteina.
Introduzione
650.000 interazioni proteina-proteina sono stimati ad esistere nel interattoma umano, gioca un ruolo critico nel mantenimento della normale funzionalità delle cellule 1,2. Oltre co-immunoprecipitazione (co-IP), il gold standard per studiare l'interazione proteina-proteina dal lisato cellulare, parecchi frammenti proteici saggi di complementazione (PCA) sono stati sviluppati per migliorare la sensibilità nella rilevazione di interazione proteina-proteina all'interno delle cellule 3. Le tecniche includono Förster Resonance Energy Transfer (FRET), bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET), e bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) 4,5. BiFC si basa sull'associazione facilitato dei due frammenti di una proteina fluorescente (qui usiamo Venere; una variante YFP) che sono ognuno fuso ad un potenziale partner proteine interagenti (in questo esempio si usa AKAP-Lbc e PDE4D3). Interazione dei due proteine di interesse all'interno di cellule risultati nella fluorescenza funzionali, che possono essere visualizzati da fmicroscopia luorescence utilizzando sia cellule vive o fissa 6,7,8. Rispetto ad altri APC, BiFC è sensibile e tecnicamente meno impegnativo, con la possibilità di studiare la localizzazione cellulare in cellule vive. Un grave inconveniente di questa tecnica tuttavia è che una volta formato, il complesso proteina fluorescente non può essere invertito. Quindi non è un buon metodo per studiare l'interazione proteina-proteina dinamico. In questo lavoro, si usa BiFC per mappare i siti di interazione di PDE4D3 con AKAP-Lbc monitorando le intensità di fluorescenza di Venere. Rispetto ai tradizionali analisi mediante microscopia a fluorescenza, che richiede tempo e manodopera (se non effettuata con macchine ad alta velocità automatizzato), citometria a flusso fornisce un'analisi quantitativa diretto di migliaia di cellule in una popolazione eterogenea in un breve tempo 9, 10. Qui, effettuando un confronto side-by-side di analisi citofluorimetrica-BiFC e co-IP tradizionale, dimostriamo che i due metodi forniscono dati comparabili, tuttavia, il flusso di analisi BiFC citometria richiede meno tempo e utilizza meno materiale che potrebbe essere più utile quando le cellule di interesse sono limitati.
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Protocollo
1. Trasfezione delle cellule
- Cellule piastra il giorno prima della transfezione, placcatura meno cellule per immunofluorescenza.
- Per immunofluorescenza: in un 6-pozzetti, cappotto di vetro coprioggetto (1 per bene) con il 0,02% di gelatina a 37 ° C per almeno 4 ore, lavare una volta con il mezzo, e per ogni bene, piastra 1 x 10 5 HEK 293T cellule in 2 ml di mezzo di crescita completo [mezzi di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) più 10% FBS].
- Per le analisi di citometria a flusso e Western Blot: piatto 1,2 x 10 5 HEK 293T cellule / pozzetto in 2 ml di terreno di coltura completo in 6 pozzetti (0,3 x 10 5 HEK 293T cellule in 0,5 ml di mezzo di coltura completo per pozzetto in piastra da 24 pozzetti ).
- Preparare DNA per trasfezione secondo il protocollo di produzione: Effectene (Qiagen) viene utilizzato per l'immunofluorescenza. Transit-LT1 (Mirus) è utilizzato per le analisi di flusso citometria e Western Blot. Quantità di DNA utilizzato è elencato di seguito.
Trasfezione usando Effectene (6 pozzetti):24-pozzetti (ng) 6 pozzetti (ng) CFP-vettore 10 50 VN N-AKAP-Lbc 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC-N-PDE4D3 UCR1 (un frammento N-terminale PDE4D3 contenente il dominio UCR1) 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (un frammento C-terminale PDE4D3 contenente i domini UCR2 e catalitici) 100 - Aggiungi quantità indicata di DNA plasmidico + 4 pl enhancer a 100 microlitri di buffer CE, mescolare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 5 Effectene ml, mescolare e incubare per 10 minuti atemperatura ambiente. Aggiungere goccia a goccia per le cellule.
- Aggiungere quantità indicata di DNA plasmidico a 250 μl/50 pl di Opti-MEM I mezzo privo di siero in una provetta sterile.
- Aggiungere il reagente Transit-LT1 alla miscela di DNA diluito e pipettare delicatamente per mescolare. (Transito-LT1 reagente: rapporto di DNA è di 3 ml di transito LT1-reagente per 1 mg di DNA).
- Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente ed aggiungere goccia a goccia alle cellule.
2. Preparazione delle cellule per la citometria a flusso, Western Blot, e immunofluorescenza
- 24 ore dopo la trasfezione, controllare la fluorescenza sotto microscopio a epifluorescenza prima che le cellule raccolta.
- Preparazione delle cellule per l'analisi di citometria a flusso:
- Lavare le cellule con 0,5 ml / 2 ml PBS freddo per lastre 24-well/6-well.
- Staccare le cellule utilizzano 50 μl/250 microlitri 0,05% tripsina.
- Neutralizzare la tripsina con 200 pl / 1 ml di DMEM.
- Collect 250 cellule microlitri (sia per piastra da 24 pozzetti e 6 pozzetti) per centrifugazione a 500 xg per 5 min, utilizzare i restanti cellule (1 ml) per l'analisi Western blot.
- Risospendere le cellule in 250 microlitri tampone FACS [PBS + 0,5% (w / v) di BSA + 2 mM EDTA], negozio su ghiaccio per analisi citofluorimetrica. Le celle possono anche essere fissati in paraformaldeide 1% (in PBS) se l'analisi di citometria a flusso non sarà immediata.
- Preparazione delle cellule per l'analisi Western Blot: condotta in parallelo con la preparazione delle cellule per l'analisi di citometria a flusso.
- Lavare le cellule 1x con 2 ml di PBS ghiacciato, lisare cellule aggiungendo 100 pl di tampone di lisi cellulare [10 mM tampone fosfato di sodio, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
- Raccogliere lisato cellulare mediante centrifugazione per 10 min a 21.000 xga 4 ° C.
- Quantificare la concentrazione di proteine mediante test proteina Bradford, caricare la stessa quantità di proteine per ogni corsia per SDS-PAGE, e trasferimento in nitrocellulosa per immunoblotting.
- Preparazione delle cellule per immunofluorescenza.
- Risciacquare cellule 3x con 2 ml di PBS, fissare le cellule in 1 ml di 3,7% paraformaldeide (in PBS) per 10 min a temperatura ambiente, poi lavare 3x con 2 ml di PBS per 5 min.
- Montare coprire scivolare su un vetrino, con mezzo di montaggio. Sigillare i bordi coprioggetto con smalto per unghie, se necessario.
- Conservare i vetrini a 4 ° C prima dell'esame.
3. Citometria a flusso e microscopia di immunofluorescenza
- Citometria di flusso viene eseguita usando un Beckman Coulter Ciano ADP, dotato di 488 nm, 405 nm e 642 nm laser allo stato solido. Software Summit è utilizzato per l'acquisizione e l'analisi.
- Calibrare citofluorimetro utilizzando perline standard.
- Diagramma a dispersione in avanti (FSC) / Orientabilità scatter (SSC) su una scala lineare per gating popolazione di cellule vive.
- Trama larghezza di impulso FSC / tensione di gating non aggregata popolazione di cellule vive.
- Trama count/FL6 (PCP fluorescence, 405 nm) su scala logaritmica per gating non aggregati cellule CFP-positive vivi.
- Trama count/FL1 (YFP fluorescenza, 488 nm) su una scala logaritmica per l'intensità BiFC.
- Esegui campioni YFP-CFP-Double Negative, regolare FSC, SSC, FL1 e FL6 tubo foto moltiplicatore (PMT) per impostare la tensione di soglia per ogni segnale.
- Esegui unico positivo (entrambi + + YFP e CFP) i campioni per il futuro di compensazione off-line
- Acquisire almeno 10.000 eventi recintata (+ cellule PCP vivo non aggregati) per l'analisi.
- Microscopia ad immunofluorescenza viene eseguita utilizzando un Zeiss LSM 510 microscopio confocale. Nota: è importante mantenere tutte le impostazioni (come ad esempio lo zoom, foro stenopeico, il guadagno del rivelatore, amplificatore offset, dimensione del frame, velocità di scansione, scansione media, e la potenza del laser) coerente tra campioni per una corretta comparazione di tutti i dati.
4. Analisi dei dati (effettuata utilizzando il software Summit)
- Impostare il protocollo di analisi simile a quella per Acquisizione con una corretta gating:
Gate 1 in FSC / SSC dot plot per le cellule vive.
Gate 2 in FSC / larghezza di impulso di Gate 1 per le cellule vive non aggregati.
Gate 3 nel conteggio / CFP di Gate 3 per CFP non aggregata + cellule vive. - Compensare YFP e CFP segnale usando + e + PCP cellule positive singole YFP.
- Rideterminare le linee di taglio per le cellule CFP / YFP-positivo.
- Export YFP fluorescenza media (MFI) di PCP + celle in Excel per i dati-stampa.
- Normalizzare YFP IFM ai livelli di espressione di AKAP-LBC PDE4D3, e il caricamento di controllo α-tubulina, come determinato da Western Blot.
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Risultati
AKAP-Lbc e PDE4D3 costrutti (Figura 1B) sono state fuse a VN e frammenti VC, rispettivamente. Interazione di AKAP-Lbc e PDE4D3 risultati in funzionale YFP fluorescenza (Figura 1A). Qui usiamo il metodo BiFC per mappare i siti AKAP-LBC-vincolanti in PDE4D3. Regione a monte conservata 1 (UCR1), regione a monte conservato 2 (UCR2) e regione catalitica (CAT) sono conservati tra PDE4 proteine della famiglia, quindi, tutta la lunghezza (FL), UCR1 e UCR2 più CAT sono stati utilizzati per lo ...
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Discussione
BiFC è un metodo semplice e sensibile per studiare l'interazione proteina-proteina. Questo metodo non può essere usato per identificare nuove interazioni proteina-proteina, tuttavia, è particolarmente conveniente per confermare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule e per studiare le proprietà funzionali, quali localizzazione subcellulare dei complessi proteici, mappatura dei siti di interazione proteina-proteina, e per lo screening di piccole molecole / peptidi che possono modulare l'...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo il laboratorio O'Bryan a UIC per la valutazione sperimentale critica e discussione. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association Concessione 11SDG5230003 di GKC e National Center for Advancing Science Translational - Centro UIC per Scienze Cliniche e traslazionale sovvenzione UL1TR000050.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’ s Aquila modificata’ s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilina-Streptomicina (penna/streptococco), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anticorpo anti-bandiera | Sigma | M2, F1804 | |
| Anticorpo anti-HA | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulina | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anticorpo anti-GFP | Clontech | 632569 | |
| Piastre per colture cellulari, coltura tissutale a 6 pozzetti trattata | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| cellule HEK 293T ATCC | CRL-11268 | ||
| Kit di purificazione plasmidico Maxiprep, alta velocità | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’ s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Tripsina-EDTA, 0,05% (p/v) | Gibco | 25300 | |
| Provette in polistirene a fondo tondo per colorazione FACS | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldeide | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Reagente antisbiadimento all'oro prolungato con DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Vetrini per microscopio Superfrost plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest vetro di copertura premium | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubatore | NuAIR DH autoflow | ||
| Microscopio confocale LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Unità di trasferimento e elettroforesi | Biorad | ||
| Cyan ADP Citometro a flusso | Beckman Coulter |
Riferimenti
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- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
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- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
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