Qui si descrive un metodo efficace per il frazionamento di membrane plasmatiche vegetali solubili nelle membrane resistenti e detergenti detergenti a base di miscela di non marcato e in vivo completamente 15 N etichettati colture cellulari Arabidopsis thaliana. La procedura viene applicata per studi di proteomica comparativi per capire i processi di segnalazione.
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Articolo metodologico
Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del
In questo articolo
Sommario
Abstract
Plasma microdomini di membrana sono caratteristiche basate sulle proprietà fisiche dell'ambiente lipidi e steroli e particolari ruoli nei processi di segnalazione. Estrazione microdomini di membrana arricchiti di steroli dalle cellule vegetali per l'analisi proteomica è un compito difficile, soprattutto a causa molteplici fasi di preparazione e le fonti di contaminazioni provenienti da altri compartimenti cellulari. La membrana plasmatica costituisce solo circa il 5-20% di tutte le membrane in una cellula vegetale, e quindi l'isolamento della frazione di membrana plasmatica altamente purificato è impegnativo. Un metodo utilizzato frequentemente comporta acquosa partizionamento bifase in polietilene glicole e destrano, che produce vescicole della membrana plasmatica con una purezza del 95% 1. Ricchi di steroli microdomini di membrana all'interno della membrana plasmatica sono insolubili in seguito al trattamento con detergenti non ionici fredde a pH alcalino. Questa frazione di membrana resistente ai detergenti può essere separato dalla membrana plasmatica bulk mediante ultracentrifugazione in quantogradiente ucrose 2. Successivamente, le proteine possono essere estratti dalla banda bassa densità del gradiente di saccarosio da metanolo / cloroformio precipitazione. Proteina estratta sarà poi tripsina digerito, dissalato e, infine, analizzato da LC-MS/MS. Il nostro protocollo di estrazione per microdomini ricchi di steroli è ottimizzato per la preparazione di detergenti puliti resistente membrana frazioni da colture cellulari Arabidopsis thaliana.
Usiamo piena marcatura metabolica di Arabidopsis thaliana colture cellulari sospensione con K 15 NO 3 come unica fonte di azoto per studi di proteomica comparativi quantitativi in seguito al trattamento biologico di interesse 3. Mescolando uguali indici di colture cellulari etichettati e non etichettati per l'estrazione delle proteine congiunta l'influenza della procedura di preparazione sul risultato quantitativo finale è mantenuta ad un minimo. Anche la perdita di materiale durante l'estrazione interesserà sia il controllo e campioni di trattamento nello stesso modo, und quindi il rapporto di luce e sollevamento peptide rimarrà costante. Nel metodo proposto sia etichettato o coltura cellulare non marcato subisce un trattamento biologico, mentre l'altro serve come controllo 4.
Introduzione
Nel 1972, Jonathan Singer e Garth Nicolson proposto il modello a mosaico fluido un modello struttura delle membrane cellulari, sostituendo il modello panino proteina-lipide-proteina che è stata generalmente accettata nei primi anni 1960. Singer e Nicolson postulato che la membrana biologica può essere considerato come un liquido bidimensionale in cui tutte le molecole lipidiche e proteiche diffondersi liberamente e facilmente 5. Da allora, struttura tipo della membrana plasmatica e la conoscenza della composizione membrana è diventata ancora più complessa. In particolare, all'interno della membrana plasmatica, strutture come complessi proteici basati l....
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Protocollo
PROCEDURA
Reagenti e tamponi comunemente utilizzate nel protocollo di estrazione:
- JPL mezzo per Arabidopsis thaliana colture cellulari di sospensione
- 3 mM H 3 BO 3
- 3 micron MnSO 4 x H 2 O
- 1.1 micron ZnSO 4 x 7 H 2 O
- 0.15 micron KJ
- 0,03 mM Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O
- 3 nM CoCl 2 x 6 H 2 O
- 3 nM CuSO 4 x 5 H 2 O
- 0.9 mM CaCl 2 x 2 H 2 O
- 0.5 MgSO mm 4 x 7 H 2 O....
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Risultati
Con il protocollo presentato utilizzando colture cellulari Arabidopsis marcate metabolicamente è possibile isolare le membrane plasmatiche da tessuto vegetale (step2, figure 2 e 4), e per arricchire resistente detergenti frazioni di membrana all'interno della membrana plasmatica (passaggio 3, figure 3 e 5). Successivamente, il protocollo consente l'estrazione di proteine da questi detergenti resistente frazioni di membrana (step 4) e digestione della proteina per anal.......
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Discussione
Il protocollo qui presentato contiene molti passaggi e tutti sono cruciali per ottenere frazionamento puro e rappresentativo della membrana plasmatica pianta nelle membrane resistenti detersivo e frazioni solubili detergenti. Pertanto, è importante seguire ogni passo le istruzioni.
Trattamento della frazione di membrana plasmatica con detergente non ionico (passo 3.2) ha la più forte influenza sulla qualità della membrana microdomini frazionamento. Per ottenere risultati riproducibili tra di.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
L'autore, Witold Szymanski, è un dipendente dell'Istituto Max Planck di fisiologia molecolare delle piante. L'autore, Waltraud Schulze è un dipendente presso l'Università di Hohenheim, in Germania.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| I prodotti chimici sono stati ordinati da Sigma-Aldrich se non diversamente | |||
| Ammoniaca (soluzione stock al 25%) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μ m | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Glicole polietilenico(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Destrano T500 | Roth | 9219.2 | |
| Tripsina | Promega | V5113 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuga | Beckman | ||
| Plate Reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| Spettrometro di massa LTQ-Orbitrap | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
Riferimenti
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K.
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Ristampe e permessi
