Articolo metodologico

Crescita di misura e di espressione genica Dinamica di tumore-mirata S. Typhimurium Batteri

DOI:

10.3791/50540

⸱

6 luglio 2013

 ,  ,  , 
1Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego , 3Biocircuits Institute, University of California, San Diego , 4Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego , 5Broad Institute of Harvard and MIT, 6Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 7Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 8Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo di questi esperimenti è generare dati quantitativi di andamento sulla crescita e la dinamica di espressione genica di attenuato S. typhimurium Colonie batteriche che crescono all'interno dei tumori. Questo video illustra la preparazione delle cellule tumorali e l'impianto, la preparazione e l'iniezione di batteri, imaging intero animale luminescenza, l'asportazione del tumore, e la colonia batterica conteggio.

Abstract

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L'obiettivo di questi esperimenti è generare dati quantitativi di andamento sulla crescita e la dinamica di espressione genica di S. attenuato typhimurium colonie batteriche che crescono all'interno dei tumori.

Abbiamo generato tumori trapiantati in topi modello per iniezione sottocutanea di una linea cellulare di carcinoma ovarico umano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumore Repository, Frederick, MD).

Abbiamo trasformato ceppi attenuati di S. batteri typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) con una luciferasi costitutivamente espresso (luxCDABE) plasmide per la visualizzazione 2. Questi ceppi specificamente colonizzano tumori rimanendo essenzialmente non virulento al mouse 1.

Una volta tumori misurabili sono stati stabiliti, i batteri sono stati iniettati per via endovenosa attraverso la vena della coda con diversi dosaggi. Tumore localizzato, espressione del gene batterico è stata monitorata in tempo reale nel corso di 60 ore utilizzando unnel sistema di imaging in vivo (IVIS). Ad ogni tempo, i tumori sono stati asportati, omogeneizzato, e piastrate per quantificare colonie batteriche per la correlazione con i dati di espressione genica.

Insieme, questi dati produce una misura quantitativa della crescita in vivo e la dinamica di espressione genica dei batteri in crescita all'interno dei tumori.

Introduzione

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La biologia sintetica è progredita rapidamente nel corso degli ultimi dieci anni ed è ora posizionato a impatto dei problemi importanti nella energia e salute. Tuttavia, l'espansione in ambito clinico è stato rallentato da problemi di sicurezza e l'assenza di sviluppo di criteri di progettazione per circuiti genetici in vivo. Accelerare le applicazioni mediche di grande impatto richiede metodi che si interfacciano direttamente con infrastrutture mediche, circuiti genetici che funzionano al di fuori del setting di laboratorio controllato, e padroni di casa microbici sicuri e clinicamente accettato che utilizza.

Un numero di ceppi sono state studiate per la terapia del cancro a causa della loro capacità di crescere preferenzialmente nei tumori. Questi hanno incluso C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ha generato particolare interesse come hanno esibito la sicurezza e la tolleranza in un certo numero di prove cliniche umane 9-12. Questi batteriologiche un stati inizialmente mostrati per creare effetti antitumorali attraverso la stimolazione del sistema immunitario dell'ospite e dalla deplezione di sostanze nutritive necessarie per il metabolismo delle cellule del cancro. Produzione di merci terapeutico è stato poi aggiunto attraverso modificazioni genetiche. Mentre questi studi rappresentano importanti progressi nell'uso di batteri per le terapie tumorali, la maggior parte degli sforzi esistenti hanno fatto affidamento su un'espressione di alto livello, che in genere si traduce nella fornitura di alti dosaggi, effetti off-target, e lo sviluppo di resistenza dell'ospite 13-16 .

Ora, la biologia sintetica può aggiungere la produzione del carico programmabile utilizzando circuiti genetici computazionalmente-progettati in grado di eseguire il rilevamento avanzate e di consegna 17-20. Questi circuiti possono essere progettati per agire come sistema di consegna che rilevano gli stimoli tumore-specifici e di auto-regolare la produzione di merci, se necessario. Tuttavia, studiando la funzione di questi circuiti in vivo è stato quindi finora impegnativo.

ve_content "> Dal plasmidi sono il quadro di riferimento comune per i circuiti sintetici, si descrive un metodo per caratterizzare la dinamica di espressione genica plasmide-based in vivo, utilizzando un modello di topo. Questi metodi utilizzano time-lapse luminescenza imaging e misurazione quantitativa di biodistribuzione. Insieme, questi approcci forniscono un quadro per studiare le reti basate plasmide in vivo per applicazioni cliniche.

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Protocollo

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1. Preparazione delle cellule

  1. Linee cellulari passaggio utilizzando tecniche standard di coltura cellulare. In questo esperimento, abbiamo utilizzato OVCAR-8 (NCI DCTD Tumore Repository, Frederick, MD). Coltivare le cellule a un target confluenza di 80 - 100%.
  2. Incubare le cellule con 5 ml di tripsina per 5 minuti, quindi aggiungere 5 ml di terreno RPMI + FBS per inattivare la tripsina.
  3. Celle di raccolta e di contare su un emocitometro. Risospendere in rosso fenolo-DMEM privo bersaglio ad una concentrazione di 5 x 10 7 cellule / ml, o circa 200 pl per bombola.
  4. Aggiungere 15% ridotta del fattore di crescita Matrigel (BD Biosciences) e mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino all'impianto.

2. Impianto del tumore

  1. Anestetizzare 4 settimane vecchia femmina Ncr / Nu topo, utilizzando 3% isoflurano e attendere circa 5 minuti per garantire l'anestesia profonda. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  2. Caricare le cellule (100 microlitri per tumore) in una siringa da 1 ml e allegare un 27 1/ 2 ago calibro.
  3. Per ciascuno dei due siti di iniezione fianchi posteriori bilaterali, sollevare delicatamente la pelle con una pinza per fare una tenda e iniettare le cellule alla base. Fare attenzione a non penetrare troppo in profondità, producendo sangue. Utilizzare le pinzette per rimuovere delicatamente la siringa senza spruzzi.
  4. Monitorare la crescita del tumore al giorno per 10-20 giorni fino a un diametro del tumore di 2 - viene raggiunto da 4 mm.

3. Batteri Preparazione

  1. Avviare una cultura durante la notte di batteri in 3 ml di LB + ampicillina multimediale da un -80 C magazzino congelatore o piastra refrigerata. In questo esperimento, abbiamo utilizzato S. typhimurium ceppo ELH430 (SL1344 PhoPQ-Aroa-).
  2. La mattina, diluire la cultura 1:100 in LB filtrata e crescere per OD600 0,4-0,6.
  3. Spin down e lavare 3 volte in tampone fosfato salino (PBS) e risospendere ad una finale OD600 di 0,1 (circa 1 x 10 7 cellule / ml).

4. Batteri Iniezione

  1. Anestetizzare l'animale unposizione d su un lato con la coda rivolta verso la mano dominante. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  2. Dilatare la vena caudale utilizzando acqua calda o una lampada di calore.
  3. Caricare i batteri (100 microlitri per topo) in una siringa da 1 ml e piegare la punta poco meno di 90 gradi.
  4. Allineare la punta della siringa con la vena della coda, penetrare a bassa profondità (dovrebbe sentire alcuna resistenza), e iniettare batteri. Osservare lo spostamento flusso sanguigno per una iniezione di successo.

5. Topo Imaging

  1. Anestetizzare gli animali nella camera di induzione quindi posizionare ogni mouse sulla piattaforma di imaging. Utilizzare vet unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Mantenere il posizionamento preciso per garantire risultati quantitativi tra i punti di tempo.
  2. Animali immagine utilizzando il sistema di imaging Spectrum IVIS (Caliper Life Sciences). Se l'imaging più di 1 animale, luogo fotocellule tra di loro per evitare cross-illuminazione. Animali dovrebbero essere ripreso prima sul lato ventrale per confermare la localizzazione di batteri.
  3. Animali Immagine dorsalmente con IVIS ogni 2 ore per la durata dell'esperimento (36 ore). Generare un corso di tempo per un dato ROI.

6. Quantificare Biodistribuzione batterica

  1. Euthanize animali utilizzando CO 2 e posto sul retro su un pannolino assorbente.
  2. Girare l'animale per esporre i due tumori posteriori fianco sottocutanei. Tagliare il tessuto della pelle circostante per separare e rimuovere i tumori. Tenendo il tumore con una pinzetta, togliere la pelle con un movimento a forbice rovesciata. Quando la maggior parte della pelle è stata separata, rimuovere completamente il tumore usando pinzette.
  3. Posizionare gli organi in provette da microcentrifuga pre-pesati. Poiché la massa di questi tubi può variare significativamente è importante per loro pre-pesare per risultati quantitativi.

7. Quantificare Biodistribuzione batterica

  1. Per ogni punto, accise e pesare i tumori.
  2. Aggiungere 500 microlitri di PBS + 15% glicerolo e omogeneizzare con un tessuto-Tearor (BioSpec). Sciacquare l'omogeneizzatore 3 volte con etanolo tra i campioni.
  3. Generare diluizioni seriali e piastra per il conteggio delle colonie batteriche. Per piastra diluizioni multiple su un'unica piastra Usare piatti pre-sezionati.

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Risultati

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Usando questo protocollo, siamo in grado di generare dati sulla crescita in vivo e la dinamica di espressione genica dei batteri mirati tumorali. Il flusso di lavoro generale è riassunto in Figura 1.

Nella prima fase, abbiamo iniettare batteri (verde) e l'immagine dell'animale utilizzando IVIS per misurare l'espressione genica con luminescenza (blu) come reporter.

Poi, nella seconda fase, abbiamo accise, omogeneizzare, e tumori piastra p...

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Discussione

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Utilizzando questa procedura, siamo in grado di generare corsi di tempo per la crescita e la dinamica di espressione genica dei batteri colonizzano i tumori. Mentre queste misurazioni sono eseguite di routine in vitro in coltura batch o dispositivi microfluidici, sono molto più difficili da eseguire in vivo.

Ci sono diverse modifiche che possono essere applicate a questi metodi. Mentre abbiamo utilizzato la linea cellulare OVCAR-8 per generare nostri modelli murini, un cert...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Ringraziamo H. Fleming per la lettura critica e la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato Misrock (TD) e NDSEG Graduate Fellowship (AP). BNS è un investigatore HHMI.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mlBD Biosciences309602
Siringa da insulina da 3/10 ccBD Biosciences309301
Ago PrecisionGlide BD Biosciences301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquido, con L-glutamminaInvitrogen11875-119
AmpicillinaSigma AldrichA0166-5G
LB Agar BrodoSigma AldrichL2897
Luria-Bertani brodoBD Biosciences244610

Riferimenti

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