Method Article

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

DOI:

10.3791/50541

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August 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, 2Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., 3Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, 4Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

In This Article

Summary

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Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Abstract

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Caratterizzazione quantitativa delle interazioni della proteina è essenziale in praticamente ogni campo delle scienze della vita, in particolare di scoperta di nuovi farmaci. La maggior parte dei metodi attualmente disponibili di determinazione K D richiedono accesso purificata proteina di interesse, di generazione che può essere lunga e costosa. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente di determinare l'affinità di legame per thermophoresis microscala (MST) senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il metodo prevede sovraespressione della proteina GFP-fuso e lisi cellulare in condizioni non denaturanti. Applicazione del metodo di STAT3-GFP espresso transitoriamente in cellule HEK293 permesso di determinare per la prima volta l'affinità del fattore di trascrizione ben studiato per oligonucleotidi con sequenze differenti. Il protocollo è semplice e può avere una varietà di applicazione per studiare le interazioni delle proteine ​​con piccole molecole, peptidi, DNA, RNA, e proteins.

Introduction

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Caratterizzazione quantitativa di affinità di interazioni intermolecolari è importante in molti settori della ricerca biomedica. Legame costante di dissociazione (K D) è essenziale non solo nella scoperta della droga, ma è anche un parametro importante caratterizzazione di ogni interazione binaria in qualsiasi sistema biologico. Metodi biochimici utilizzati per il rilevamento di interazioni proteina-proteina, come la immunoprecipitazione e lievito schermi a due ibridi, non ci informano su quanto stretto sono quelle interazioni, mentre affinità definisce se questo particolare complesso esiste in determinate condizioni in vivo. Nel processo di scope....

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Protocol

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1. Preparazione del lisato

Questo protocollo è destinato cellule aderenti esprimono alcuna proteina GFP-fusa. Numero di cellule necessarie possono variare da un minimo di 10 6 di ben 20 x 10 6 cellule, a seconda del livello di espressione della proteina. Per esempio, lisato di cellule HEK overexpressing GFP-STAT3 è stato preparato trattando cellule coltivate in fiasche T75 10 vicino al 70% di confluenza con 1 ml di tampone di lisi. Tuttavia, questo lisato stati diluiti 150 volte per fornire il livello ottimale di fluorescenza per esperimento MST. Protocollo di lisi cellulare dipende fortemente dalle proprietà e la loca....

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Results

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Misurando l'affinità di non fosforilata STAT3 legame proteico oligonucleotidi.

Cellule HEK293 esprimenti STAT3-GFP sono stati utilizzati come fonte di fluorescente STAT3 per saggio di legame al DNA. I lisati cellulari sono stati preparati usando tampone RIPA (20x10 6 cellule / ml). Per studi di legame, i lisati sono stati diluiti con 150x MST tampone di legame al DNA per fornire il livello ottimale della proteina fluorescente nella reazione di legame (circa 20 nM). H.......

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Discussion

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Espressione e purificazione di proteine ​​è un passo laboriosa e costosa, che è, tuttavia, necessario per la determinazione delle interazioni 'K D dal metodo più usato. Applicazione del MST permette di evitare la purificazione di proteine ​​così in modo significativo semplificare ed accelerare la caratterizzazione quantitativa delle interazioni. Esso presenta vantaggi particolarmente significativo nel caso di-to-esprimere difficili e purificare proteine, quali le proteine ​​di membrana e fattori di trascr.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Il contenuto di questa pubblicazione non riflettono necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento di Salute e Servizi Umani, né menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali, o organizzazioni implica l'approvazione da parte del Governo degli Stati Uniti.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Cancer Institute, Centro per la Ricerca sul Cancro; accordo di collaborazione di ricerca tra NSC e Calidris Therapeutics, American Cancer Society concessione IRG 97-152-17 di OT, e fondi federali dal National Cancer Institute, NIH, sotto HHSN26120080001E contratto.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tampone RIPAMillipore20-188Funzionano anche tamponi di altri produttori
Cocktail di inibitori della proteasiSigma-AldrichP2714
Monolith NT.115NanoTemper Technologies GmbHG008
Monolith NT.115 Vassoio capillareNanoTemper Technologies GmbHT001
Monolith NT.115 Trattato standard CapillariNanoTemper Technologies GmbHK002
NT Software di controlloNanoTemper Technologies GmbH2.0.2.29
NT Software di analisiNanoTemper Technologies GmbH1.4.27
Centrifuga refrigerata da tavoloEppendorf5417RAltre centrifughe refrigerate per microprovette che forniscono
Protein LoBind Tube 0,5 mlEppendorf22431064

References

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  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme....

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Microscale ThermophoresisBinding Affinity DeterminationProtein Purification free MethodGFP fused ProteinCell Lysate AnalysisLigand Dilution SeriesFluorescence MeasurementThermophoresis ExperimentSTAT3 GFP TransfectionOligonucleotide Binding Assay

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