Descriviamo la dissezione del sistema nervoso della marina mare lepre Aplysia Dopo l'anestesia, l'isolamento dei neuroni per termine cultura dei tessuti di breve, e registrazioni di correnti di singolo ione delle cellule attraverso la tecnica del patch clamp.
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Articolo metodologico
Isolamento dei neuroni sensoriali
In questo articolo
Sommario
Abstract
La marina Aplysia californica mollusco gasteropode ha una storia venerabile come un modello di funzione del sistema nervoso, con particolare rilievo negli studi di apprendimento e memoria. Le preparazioni tipiche per questo tipo di studi sono quelli in cui la sensoriali e motoneuroni sono lasciati intatti in un animale minimamente sezionato, o di un elaborato tecnico neuronale co-coltura di sensoriale individuale e motoneuroni. Meno comune è l'isolato preparazione neuronale in cui piccoli gruppi di neuroni nominalmente omogenee sono dissociate in singole cellule in coltura a breve termine. Tali cellule isolate sono utili per la caratterizzazione biofisica di correnti ioniche con tecniche di patch clamp, e modulazione mirato di questi conduttanze. Un protocollo per la preparazione di tali colture è descritto. Il protocollo sfrutta le facilmente identificabili neuroni sensoriali glutammatergiche dei gangli pleurico e buccale, e descrive la loro dissociazione e la manutenzione minima in coltura per diversi giorni senza siero.
Introduzione
Il mollusco opistobranch marino, Aplysia, è stato un modello neurobiologico utile per molti decenni. E 'meglio conosciuto come modello di assuefazione e di condizionamento classico 7, 8. Gli studi sull'apprendimento e la memoria in questo modello ha vinto il premio Nobel per la fisiologia o la medicina nel 2000 per Eric R. Kandel, in un premio che divideva con Arvid Carlsson e Paul Greengard 10. Gli studi che coinvolgono registrazioni elettriche da preparativi ridotti, in cui gli elementi del sistema nervoso di questo invertebrato sono sezionati dall'animale con nervi e muscoli che si trovino, hanno contribuito a chiarire i ruoli dei singoli neuroni in Aplysia. Identificazione dei meccanismi molecolari precisi che costituiscono l'apprendimento in Aplysia però, spesso utilizzato un'altra tecnica, a lungo termine co-colture di un neurone sensoriale e di un motoneurone, ottenuto uno per uno dai singoli animali donatori e ha permesso di formare una sinapsi nel piatto cultura 21 .
Noi e altri 1, 3, 6, 14, 15, 16, abbiamo sfruttato la facilità con cui identificare i neuroni possono essere mirati in questo modello, così come la loro resistenza in esperimenti a lungo termine per rendere le culture a breve termine dissociate di gruppi di neuroni nominalmente omogenee in cui studiarne correnti ioniche sotto voltage clamp nella configurazione di patch clamp. Molti neuroni Aplysia resistono a ripetuti cicli di patch di bloccaggio per consentire il tempo per le manipolazioni sperimentali di lunga durata. La tecnica è utile per i neuroni, come le cellule del sacchetto neurosecretory del ganglio addominale, ei neuroni sensoriali dei gangli pleurico e buccali cui dissociazione descriviamo qui, ma non per molto grandi neuroni> 60 micron di diametro, come L7 o R2 di il ganglio addominale. Noi non utilizziamo Aplysia siero nelle nostre culture, a differenza dei sensori-motoneurone co-culture descritte altrove. La maggior parte dei neuroni ottenuti con questa procedura sono senza processi per tegli prima 48 ore di cultura, facilitando intera registrazione tensione di cella, ma poi germogliare e elaborare assoni e di altri processi per circa 14 giorni prima di morire per mancanza di nutrienti e / o fattori di crescita.
Questa tecnica produce colture primarie di neuroni per 50-100 piatto da regioni fisiologicamente documentate dei gangli buccale e della pleura. Questo protocollo è utile per i ricercatori che studiano gli aspetti della singola fisiologia cellulare in esperimenti che richiedono numerosi sperimentale repliche per animale. Si produce una coppia di culture dovute alla separazione anatomica delle cellule bersaglio in hemiganglia destra e sinistra, permettendo studi che beneficio dal trattamento accoppiati e colture di controllo.
Il protocollo mira buccali S a grappolo (BSC) neuroni del ganglio buccale e pleuriche ventrocaudal (PVC) neuroni del ganglio pleurico. Queste cellule sono in una dimensione appropriata per intere registrazioni di tensione delle cellule e ROBUS visualizzazionet risposte glutamatergiche. La metodologia discusso è appropriato per la maggior gangli del sistema nervoso Aplysia.
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Protocollo
1. Preparazione delle cellule
- Il giorno 1, pesare e anestetizzare animali.
- Pesare 30 g-1 kg di animale. Anestetizzare in 5-10 volumi di animali di acqua di mare: 01:01 MgCl isotonica. 6H 2 0 per 1 ora con aerazione ad esempio una pompa di aria dell'acquario elettrica con airstone allegata.
- Preparare forniture di dissezione.
- Assemblare vassoio dissezione pulita con perni diritti inox quali spine tessuto. Assemblare diverse piastre di Petri contenenti acqua di mare artificiale (ASW; vedi tabelle 1 e 3) + penicillina / streptomicina (P / S).
- Avere pronto un microscopio a bassa potenza. Avere gli strumenti di dissezione pulita pronta, come ad esempio il naso a coste e una pinza sottile chirurgici, e fine e grandi forbici chirurgiche. Spruzzare gli strumenti con il 70% di alcol isopropol prima dell'uso e lasciare asciugare.
- Posizione animale sul vassoio dissezione.
- Posizione animale lato ventrale verso il basso nel vassoio dissezione. Animale Pinattraverso bordi della parete del corpo e confini parapodial, ma evitare la coda e la testa, per esporre la superficie dorsale e il solco genitale
- Sciacquare la superficie dorsale in acqua fredda con esecuzione lenta. Applicare un leggero flusso di 70% di alcol isopropol da una bottiglia di compressione lungo la scanalatura genitale e sopra la parte superiore della testa.
- Fai l'incisione iniziale.
- Utilizzando un microscopio a bassa potenza (vedere Tabella 2) e riflessa per osservare il punto in cui la scanalatura genitale origina dal margine anteriore guscio, teso tenere con una pinza Poly-naso una piega di tessuto a sinistra di questa origine, mentre snipping un superficiale Hole il percorso attraverso il liscio, zona pianeggiante della parete del corpo appena a destra della scanalatura genitale con sottili forbici angolate.
- Emolinfa deve essere osservato per versare dal foro, talvolta portando con sé il ganglio addominale e stomaco.
- Espandere l'incisione.
- Utilizzare forbici grandi per espandere °incisione e anteriormente ad un punto tra le rhinophores, mentre si tira verso l'alto con la lama inferiore per evitare intaccare l'intestino. Gli organi interni saranno osservate per fuoriuscire l'incisione.
- Rimuovere i gangli.
- Riposizionare il vassoio e rimettere a fuoco il microscopio sulla regione della testa.
- Utilizzando pinze pulite e forbici sottili, togliere i gangli testa da troncare a un certo punto i nervi che costituiscono i gangli testa in un anello intorno all'esofago per rimuovere pleurico-pedale e cerebrale gangli come gruppo.
- Rimuovere il ganglio buccale che aderisce al lato ventrale dell'esofago.
- Rimuovere il ganglio addominale tagliando le 4 grandi connettivi nervosi che emettono da questo ganglio.
- Isolare gangli di interesse.
- Tagliare testa gangli a parte, lasciando una lunghezza dei connettivi collegati a ciascun ganglio di interesse che è pari ad almeno il diametro del ganglio, questo ritarderà enzima sopra-digestionedelle cellule di interesse nella fase successiva.
- Mettere ogni ganglio obiettivo attraverso 2 risciacqui di ASW + P / S, muovendosi tra risciacqui con pinzette pulite.
- Se il targeting delle cellule del PVC, lasciare il giusto hemiganglion pleurico collegato al diritto hemiganglion pedale, e allo stesso modo lasciare il hemiganglion pleurico sinistro attaccato al pedale hemiganglion sinistra.
- Scartare gangli indesiderati e il resto dell'animale secondo la prassi di ricerca accettato.
- Enzimaticamente digerire i gangli.
- Per ciascun ganglio, preparare 1 ml di soluzione enzimatica costituito 3,75 mg dispasi, 1 mg ialuronidasi e 0,3 g collagenasi tipo XI per ml di ASW + P / S in un tubo da 15 ml polipropilene.
- Luogo risciacquato gangli nella soluzione enzimatica e fissare il tappo. Posizionare il tubo su un lato su un agitatore rotante (vedi tabella 2) a bassa velocità per 13-5 ore durante la notte a circa 23 ° C (temperatura ambiente).
- Preparare ilpiatti della cultura.
- Prima di microdissezione (Day 2), preparare poli-D-lisina (PDL) rivestite piatti della cultura in una cappa di coltura di tessuti. Aggiungere 0,5 ml ~ PDL (0,2 mg / ml di acqua sterile) al centro di un piatto 35 millimetri a ~ 25 min.
- Sciacquare PDL 3x con acqua sterile. Lasciare asciugare. UV-sterilizzare le piastre.
- Giorno 2 Isolare i neuroni.
- Riempire il centro di 35 piatti mm che erano PDL-rivestito UV e sterilizzato con circa 0,5 ml di ASW + P / S per creare un'isola di supporto all'interno del piatto altrimenti asciutto. Questo può essere fatto in panchina, fuori della cappa coltura tissutale. Un piatto deve essere preparato per ogni gruppo di cellule provenienti da una hemiganglion.
- Avere pronto un diametro di 100 millimetri piatto dissezione fatta da Sylgard-rivestimento e guarire una mm superficie dissezione profonda 5, dotato di sottili perni dissezione di varie dimensioni da utilizzare come perni e sonde (cfr. tabella 3). Sciacquare questo piatto con il 70% di alcol isopropol, poi con ASW + P / S, e, infine, fill con ASW + P / S.
- Preparare microdissezione dei gangli digerito.
- Versare la soluzione enzimatica contenente il pleurico-pedale e buccale gangli digerito nel piatto dissezione.
- Porre la capsula sul palco del microscopio contro una superficie nera sotto luce riflessa.
- Utilizzando il tessuto connettivo allegata, definire con precisione ogni pleurico-pedale hemiganglion lato dorsale alto. I tessuti saranno morbidi e intollerante di stretching.
- Microdissect neuroni in PVC.
- Utilizzando due coppie di pinze sottili puliti, e in possesso di un perno di dissezione multa in un paio di pinze come sonda, isolare le cellule del PVC da un hemiganglion pleurico. Digestione enzimatica avrà rimosso o rotto a parte il tessuto connettivo che copre il cluster PVC, ma le cellule saranno aderire l'una all'altra.
- Usare la sonda di staccare queste cellule dal connettivo pedale-pleurica 18, poi lasciare cadere il cluster cella al fondo della dissezionepiatto.
- Trasferire i neuroni al piatto cultura.
- Trasferire il gruppo di cellule di un mm piatto preparato 35 cultura delicatamente succhiare il cluster nella punta di un po 'incendio lucidato pipetta Pasteur di vetro usa e getta, quindi l'erogazione lentamente nell'isola dei media in una capsula di Petri, facendo attenzione ad evitare l'introduzione di bolle d'aria nella pipetta. Ripetere l'estrazione del cluster PVC dell'altro hemiganglion e posto in una capsula di Petri separato.
- Microdissect e trasferire i neuroni BSC.
- Piedinatura del ganglio buccale lato ventrale, con cura per risparmiare le cellule di interesse. Ripetere il passo 1.12 con le 2 BSC gruppi di cellule del ganglio buccale 10.
- Isolamento di neuroni in PVC e BSC produrrà 4 capsule di Petri contenenti cluster di neuroni: 2 piatti contenenti cluster BSC e 2 piatti contenenti cluster PVC. Scartare il resto dei gangli e mettere da parte il piatto di 100 mm dissezione.
- Dissociate i gruppi di cellule.
- Posizionare un piatto di coltura contenente cellule sul palco del microscopio a bassa potenza e rimuovere il coperchio.
- Dissociare il cluster PVC delicatamente sfogliando il fondo del piatto cultura adiacente al cluster cella con un perno dissezione multa tenutasi a pinza. Sfogliando è scavare la punta del perno nella plastica del fondo del piatto come se cercasse di scavare una macchia di plastica. Quando l'attrito con la plastica rilascia il punto di perno, un'onda percussione viene prodotta attraverso il mezzo che si rompe il vicino ammasso di cellule.
- 5-10 colpi di frusta possono essere necessari fino a quasi dissociare completamente le cellule, ma è meglio lasciare piccoli gruppi di cellule, piuttosto che a sfogliare troppo timore le cellule distrutte dalla pura meccanica.
- Rimontare il coperchio e ripetere con altri piatti della cultura.
- Conservare le colture cellulari.
- Posizionare le piastre di coltura contenenti isole dei media nei loro centri di cellule dissociate inun grande contenitore che permette la circolazione dell'aria, come ad esempio una x 25 millimetri di plastica rotondo piatto 150 Petri, e collocare questo piatto in un incubatore a 17 ° C.
- Installare nella camera di una vaschetta aperta di acqua come fonte di umidità. Lasciar riposare durante la notte. Le cellule aderiscono al rivestimento poli-D-lisina nel centro del piatto.
- Piatti della cultura diluvio.
- Il giorno 3, inondare delicatamente i piatti con 2,5 ml di ASW + P / S. Esaminare e contare le cellule utilizzando una cultura microscopio cellula invertito. Conservare nel 17 ° C incubatore.
2. Elettrofisiologia
Il metodo è di connessione standard di serraggio che è stato descritto in numerosi testi (es. Sakmann e Neher, 1995) 16. Questo protocollo funziona su cellule ≤ 100 pF capacitanza, o cellule <60 micron di diametro nei giorni 3 e 4 del protocollo. Cellule senza processi sono ottimali per la registrazione. Il seguente considerat specialeapplicano gli ioni:
- Celle più grandi possono essere sistemati con l'impostazione di configurazione dell'amplificatore 200B Axopatch impostato a β = 0,1. Attivazione di grandissime correnti può indurre le cellule a sfuggire voltage clamp. Soluzioni ASW sostituita contenuto di sale (per esempio una frazione del NaCl sostituito con impermeabile cloruro N-metil-D-glucammina) possono essere utilizzate per ridurre intera ampiezza della corrente della cella.
- Fibre piene di pipette di patch borosilicato tirato su un estrattore pipetta e riempita a metà con soluzione intracellulare (ICS), composto da 450 mM KCl e altri sali (vedi Tabella 1) sono adatti, e devono avere la resistenza di circa 0,5-1 MOhm. Se è desiderato isolamento di correnti ioniche specifici, per esempio Na + correnti in assenza di correnti di K, K + in questa soluzione può essere sostituita con altri ioni come Cs +. Cl - sostituzione di ICS con un anione impermeant è anche giustificato se si desidera un ICS più naturale9.
- Le cellule sono robusti con> 1 hr-lunghe registrazioni possibili a temperatura ambiente. La registrazione è ottimale nei giorni 3 e 4 del protocollo, che corrispondono a 24-48 ore in cultura. Dopo 48 hr vi è difficoltà a formare guarnizioni gigaohm, forse a causa di elaborazione di un glicocalice sulla superficie cellulare, e problemi di spazio clamp causati dal processo escrescenza. Le cellule sono utili, tuttavia, per gli studi di clamp non di patch, come la tossicologia, che possono essere completati in <14 d.
- ASW ed altre soluzioni di essere dispensato dal dispositivo soluzione alimentato a gravità, così come la soluzione intracellulare, devono essere filtrati con una siringa montata 0,2 micron filtro Acrodisk (Tabella 3) per eliminare le particelle fini che interferiscono con la formazione sigillo gigaohm.
- Desensibilizzazione si verifica quando si utilizza agonisti come il D-aspartato (D-Asp), quindi ~ 1-2 minuti tra le applicazioni degli agonisti è raccomandato. Al contrario, il potenziamento è spesso osservato con una rapida applicazione ripetutazione di agonisti come L-glutammato (Glu-L).
- Agonisti correnti attivati come L-Glu possono essere studiate applicando agonisti con il picospritzer pipetta. Questa pipetta è tirato la stessa della pipetta di patch e contiene agonista in ASW. Quando la punta della pipetta questa è posizionato sotto il tubo di uscita del dispositivo soluzione alimentato a gravità, e con un angolo di 45 ° dal tubo di efflusso (Figura 2F), agonista verrà rapidamente lavato via dalla cella, e desensibilizzazione sarà minimizzata. La pipetta agonista dovrebbe creare un angolo di 90 ° o più rispetto alla pipetta di patch.
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Risultati
Le posizioni dei neuroni sensoriali all'interno dei gangli che sono indirizzate in questo protocollo, i neuroni BSC e PVC sono mostrati in Figura 1. I neuroni BSC si trovano in 2 simmetriche grappoli ovale sul lato ventrale del ganglio buccale, la superficie che si affaccia dalla massa buccale nel ganglio intatto (Figura 1A). I neuroni formano PVC, cluster a forma di V bilaterali che avvolgono la superficie dorsale del ganglio pleurico verso l'asse centrale (Figura 1B).<...
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Discussione
Le tecniche di dissociazione descritti qui resa culture di neuroni sensoriali contenenti 50-100 neuroni isolati intervallati da un piccolo numero di cellule gliali e di altre cellule non identificati. Le fasi più critiche del protocollo sono il momento i gangli rimangono in soluzione enzimatica, e sfogliando, la dissociazione dei gruppi di cellule digerite a spezzare il gruppo in singole cellule. Digestione enzimatica (passo 1.8) deve essere ottimizzato alla temperatura disponibile. A 23 ° C con agitazione lenta, 13 ore...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Finanziato dal NIH P40 OD010952, la Fondazione Korein, una Università di Miami Fellowship a SLC e una borsa di studio per Maytag ATK. Gli autori ringraziano il personale delle Risorse Nazionale per l'Aplysia, così come Lauren Simonitis e Hannah Peck, che ha fornito al microscopio per una figura.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acqua di mare artificiale ASW | Sigma-Aldrich | assortiti | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Soluzione intracellulare | Sigma | assortiti | (mM): 450 KCl, 2,9 CaCl2 (2 H2O), 2,5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA e 40 HEPES-KOH, pH 7,4 |
| Poli-D-lisina | Sigma | P6407 | |
| penicillina/streptomicina aggiunta ad ASW a 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5.000 unità/ml di penicillina più 5.000 mg/ml di streptomicina |
| Dispasi neutra II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| ialuronidasi | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenasi tipo XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-glutammato (L-glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-aspartato (D-asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-metil-D-aspartato (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| acido alfa-ammino-3-idrossil-5-metil-4-isossazolo-propionico (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| Antagonisti L-Glu R | vari | ||
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Acido DL-2-ammino-5-fosfonopentanoico (antagonista NMDAR) | |||
| 2-propanolo | VWRSP | BDH1133 | |
| Soluzione di cloruro | Sigma | assortito | 25 g di FeCl3 + 25 ml di HCl concentrato + 50 ml di H2O |
| Polimero siliconico Sylgard in 2 parti | Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Fornisce una superficie di piedinatura per piccole piastre di dissezione |
| Microscopio con ingrandimento zoom 0-40x per dissezioni Wild | |||
| Techniquip 150 Watt Illuminatore a fibre ottiche | Microoptics della Florida | TQ FOI-150 | |
| orbitale RotoMix 50800 | |||
| Microscopio a contrasto di fase invertito Nikon Diaphot con obiettivi 4x, 20x (opzionale) e 40x | SR Research Ltd. | Collegamento oculare II | |
| Oscilloscopio digitale Tektronix | SR Research Ltd. | ||
| Software di acquisizione e analisi dati pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| PC con sistema operativo Windows XP o superiore | Soluzioni | Thinkserver con dischi rigidi a stato solido (80 GB) e monitor a basso rumore | |
| Estrattore per micropipette Flaming/Brown P87 | Sutter Instruments, Novato, CA& | nbsp; | |
| Axon Instruments Amplificatore a pinza Axopatch 200B con un intervallo di compensazione della capacità di 1-1000 pF; preamplificatore | Molecular Devices, Sunnyvale, CA& | nbsp; | |
| Gruppo portaelettrodo Axon instruments per preamplificatore Axopatch 200B | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Convertitore A/D Digidata 1200 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, alimentato da N2 regolabile per pressione e durata | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Tabella di isolamento dalle vibrazioni | Ametek | ||
| Faraday | produzione su misura | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipolatori | Burleigh Instruments; Thorlabs | attualmente PCS-5000; -6000 serie + monta | |
| manipolatori manuali Narishige M-152 (per sistema di perfusione e picospritzer) | Narishige USA | ||
| Pipetta a filamento in vetro, diametro esterno 1,5 mm, ID 0,84 mm - | WPI | 1B150-3 | |
| Lunghezza 3 pollici | |||
| Ag/AgCl semicella | WPI | EP4 | |
| Provette da centrifuga da 15 ml, 35-2097 Provette da centrifuga BD Falcon* | VWRSP | 21008-918 | |
| Forbici angolate | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Pinze fini | Strumenti per la scienza | 11295-00 | |
| piastre per coltura tissutale con falco da 35 mm | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm piastre per coltura tissutale; 1013 | VWRSP | 1013 | può anche essere trasformato in piccole piastre di dissezione con sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| vassoio di dissezione per animali | vari | ||
| Provette da centrifuga da 15 ml, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | Per sistema di perfusione a gravità a 6 fori |
| Clip in alluminio con estremità dei fori per le viti | Negozio di ferramenta | Per il sistema di perfusione | |
| Aghi calibro 23 (punti di sfilatura manuale) | VWRSP | Per il sistema di perfusione | |
| Tubo in polietilene 0,022"ID x 0,042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | Per sistema di perfusione | |
| H-7 supporto per pipette per array di perfusione microcap | Narishige USA | Per sistema di perfusione | |
| valvole unidirezionali | Per sistema di perfusione | ||
| Drummond Microcaps 1 μ l | VWRSP | Per sistema di perfusione | |
| Aghi calibro 18 per aspirazione (punti limati) | |||
| Tubo in polietilene | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| perni di dissezione fine | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| tubi capillari | Kimble 71900-100 | lucidati a fuoco e a forma di U in una fiamma del bruciatore Bunsen e riempiti con agar al 3% nel | |
| negozio | argilla da modellare | ||
| portapiatti per tavolino per microscopio con bagno | |||
| Pipette pasteur | VWRSP | 14672-412 | |
| lampadine per pipette | VWRSP | 53283-911 | |
| filtri per siringa acrodisk | VWRSP | 28144-040 | |
| vetro borosilicato a parete spessa da 1,5 mm di diametro | WPI | 1B150F-3 | |
| Bombola di azoto ad alta purezza e regolatore | |||
Tabelle 1-3. Elenchi di reagenti, materiali e attrezzature. |
Riferimenti
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