Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Sommario

Abbiamo sviluppato una preparazione intatto midollo cerebrale-spinale per registrare e monitorare l'attività elettrica tramite registrazione patch clamp da neuroni e altre cellule Mauthner reticulospinal in embrioni di zebrafish. Quindi, siamo in grado di registrare le correnti sinaptiche eccitatorie e inibitorie, attività del canale voltaggio-dipendente e potenziali d'azione dai neuroni chiave in un embrione in via di sviluppo.

Abstract

Cellule Mauthner (M-cellule) sono grandi neuroni reticulospinal situati nel hindbrain di pesci teleostei. Sono neuroni chiave coinvolti in un comportamento caratteristico noto come la risposta C-avviare o fuga che si verifica quando l'organismo percepisce una minaccia. La cellula-M è stata ampiamente studiata in pesci rossi adulto dove è stato dimostrato per ricevere una vasta gamma di eccitatori, segnali inibitori e neuromodulatori ^1. Abbiamo esaminato l'attività M-cella in zebrafish embrionali per studiare gli aspetti dello sviluppo sinaptico in un preparato vertebrato. Alla fine del 1990 Ali e colleghi hanno sviluppato una preparazione di patch clamp registrazione da M-cellule in embrioni di zebrafish, in cui il CNS era ^2,3,4 sostanzialmente intatto. L'obiettivo in quel momento era quello di registrare l'attività sinaptica dai neuroni romboencefalo, i neuroni del midollo spinale e del tronco muscoli scheletrici, pur mantenendo connessioni sinaptiche funzionali all'interno di una preparazione midollo cerebrale-spinale intatta.Questa preparazione è ancora usato nel nostro laboratorio di oggi. Per esaminare i meccanismi alla base dello sviluppo della plasticità sinaptica, registriamo eccitatorio (AMPA e NMDA-mediata) ^5,6 e inibitori (GABA e glicina) correnti sinaptiche di sviluppo di M-cellule. È importante sottolineare che questa preparazione unica ci permette di tornare alla stessa cella (M-cell), dalla preparazione alla preparazione di esaminare attentamente plasticità sinaptica e nella neuro-sviluppo in un organismo embrionale. I vantaggi forniti da questa preparazione includono 1) intatto, connessioni sinaptiche funzionali sulle cellule M, 2) preparazioni relativamente poco costosi, 3) una grande quantità di embrioni prontamente disponibili 4) la capacità di ritornare allo stesso tipo di cellula (cioè M- cella) in ogni preparazione, in modo che lo sviluppo sinaptico a livello di una singola cella può essere esaminato dal pesce a pesce, e 5) l'imaging di preparati interi a causa della natura trasparente degli embrioni.

Introduzione

Una delle questioni in sospeso in neurobiologia dello sviluppo riguarda il ruolo dei fenomeni di plasticità sinaptica durante la maturazione sinaptica. La nostra ricerca si concentra sulla comprensione dei meccanismi di plasticità sinaptica che sono alla base dello sviluppo, con l'obiettivo globale di comprensione del comportamento degli animali nel contesto dello sviluppo sinaptico. Per fare questo, abbiamo sviluppato una preparazione in gran parte intatto in un organismo (zebrafish, Danio rerio), che ha acquisito una notevole trazione per studi sullo sviluppo alla fine del 1990.

Il pesce zebra offre diversi vantaggi per gli studi dello sviluppo neurologico. Ad esempio, il suo genoma è sequenziato e si può eseguire abbattimenti morpholino e ko zinc-finger nucleasi mettere a tacere l'attività genica e proteica. Si può anche eseguire studi di sovraespressione e linee transgeniche possono essere costruiti ^7-9. Gli embrioni sono relativamente facili e abbondanti per acquisire ela natura trasparente dell'embrione si presta bene per imaging e studi opto-genetica. Inoltre, l'analisi comportamentale può essere eseguita, e gli esperimenti di elettrofisiologia può essere intrapresa su fibre muscolari, neuroni del midollo spinale e dei neuroni romboencefalo negli organismi in gran parte intatte, permettendo di esaminare la funzione cellulare in vivo. Importante, siamo in grado di esaminare l'attività sinaptica in non solo la stessa classe di cellule, ma nella stessa coppia di neuroni, dalla preparazione alla preparazione. In altre parole, questa è una delle preparazioni vertebrati rare in cui si può tornare nello stesso neurone, in situ, per studiare il suo sviluppo.

Per mantenere circuiteria neuronale come vitale possibile, abbiamo sviluppato un preparato in cui hindbrain e del midollo spinale sono stati lasciati intatti, mentre cerotto di serraggio da M-cellule. In questa preparazione, gli occhi, la mascella e la pelle sovrapponendo il cervello vengono delicatamente rimossi e hindbrain è peeled distanti notocorda, consentendo l'accesso alla superficie ventrale del cervello posteriore. I neuroni reticulospinal si trovano a pochi micrometri profondo e sono relativamente facilmente accessibili. A 48 ore dopo la fecondazione (HPF, alcune abbreviazioni sono elencate nella Tabella 1) le cellule sono elettricamente compatte e si può fedelmente registrare l'attività sinaptica (sia eccitatori e le correnti inibitorie), le correnti voltaggio-dipendenti e potenziali d'azione da loro.

I nostri risultati hanno suggerito che molti aspetti dello sviluppo sinaptica e la maturazione avvengono in 24 ore prima della schiusa, e quindi gran parte della nostra attenzione è focalizzata sugli organismi di età compresa tra 24 hpf a 72 HPF. Tuttavia, da 72 HPF, M-cellule sono meno compatto elettricamente e sono difficili da correttamente morsetto spazio. La tecnica può essere utilizzata per registrare non solo dalle cellule M, ma anche dai suoi omologhi, MiD2 cm e MID3 cm. Teoricamente, si può anche effettuare doppie registrazioni, da una spneurone spinale inale come un neurone motore primario e dal-cellule M, ma questo è difficile e si potrebbe sostenere che i benefici ottenuti da una tecnica così difficile non può valere lo sforzo straordinario che è richiesto.

Protocollo

1. Preparazione e dissezione

1. Preparare il piatto dissezione allineato con Sylgard. Registrazione camere da WPI (Sarasota, Florida, USA; fornitori sono elencati nella Tabella 2) sono utilizzati come dissezione piatti (Figura 1). Le camere sono progettate per vetrini e piccole rondelle di plastica vengono usati come stampi per la Sylgard. Le rondelle vengono dapprima fissato alla slitta con grasso e Sylgard liquido viene aggiunto al centro della rondella. Il Sylgard curerà notte e come lo fa, si forma un piccolo, letto circolare sul vetrino, che diventa la base del piatto dissezione. La slitta è posto nella camera di registrazione e serve come base della camera per cui la preparazione è apposto (Figura 1).
2. Preparare le soluzioni elencate nella Tabella 3. Soluzioni extracellulari devono essere lasciati a temperatura ambiente mentre soluzioni intracellulari devono essere mantenuti sterili. Si può anche aggiungere Lucifer giallo (0,1%) alla soluzione intracellulare in modo che la visualizzazione della morfologia M-cella può essere eseguita alla fine dell'esperimento. Questo serve per confermare l'identità delle cellule (Figura 2).
3. Sollevare wild type embrioni di zebrafish in acqua uovo a 28,5 ° C, e raccogliere e stadio secondo Kimmel et al. ^10. Per dissezioni, trasferire embrioni al piatto dissezione che funge anche da camera di registrazione. Anestetizzare per 7-10 minuti in una soluzione anestetizzante sale (0,02% tricaine, soluzione 1, tabella 3), che si avvicina molto fisiologica. Si può determinare se è adeguatamente anestetizzati esaminando la risposta ad una presa coda delicato.
4. Pin gli embrioni attraverso la notocorda e sul piatto Sylgard alberato con 0.001 "filo di tungsteno (Scientific Instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, USA) utilizzando 25X di ingrandimento su un microscopio da dissezione (Figura 1). Il filo di tungsteno è facilmente tagliato ina piccoli segmenti con belle forbici dissezione.
5. Regolare l'ingrandimento sulla portata dissezione a 40-50X effettuare la dissezione. Una volta che l'embrione è appuntato al piatto, la mascella, gli occhi e prosencefalo vengono rimossi con un bel paio di pinze (Dumont # 5).
6. Il hindbrain viene delicatamente staccato dalla notocorda sottostante lavorando attentamente le pinze tra la notocorda e il cervello. Hindbrain viene poi delicatamente capovolta in modo che la superficie ventrale rivolto verso l'alto. Questa posizione offre un buon accesso alla M-cellule, che sono di solito entro 5-10 micron di superficie ventrale nei giovani embrioni e ~ 20-50 micron di larve di età superiore (Figura 2A).
7. Spostare con cautela la preparazione al setup di registrazione dove l'esperimento patch clamp può essere eseguita. L'M-cellule sono visualizzate con Nomarski interferenza differenziale contrasto (DIC), anche se altri modi di rappresentazione (cioè di contrasto modulazione Hoffman o Dodt Gradiente Contrast Imaging daLuigs e Neumann, Germania) possono anche essere utilizzati.

2. Patch Clamp Recording (modalità a cellula intera)

1. Tutte le registrazioni sono eseguite in tutto modalità patch clamp cella ^11. Registrazione camere sono poste su un palco microscopio in un setup di elettrofisiologia. I nostri stadi sono fissi e il microscopio patch clamp in posizione verticale è imbullonato al microscopio di una piattaforma mobile o di un traduttore microscopio.
2. Pipette di patch clamp sono tirato su un estrattore orizzontale (P-97; Sutter Instruments Co.) da pareti sottili, vetro borosilicato ottenuto da WPI. Diametri punta della pipetta sono dell'ordine di 0,2-0,4 micron dopo fuoco lucidatura di un bordo liscio, e il codolo conico è ~ 4 mm di lunghezza.
3. Fissare la pipetta alla testa-stadio amplificatore nel setup elettrofisiologia. È importante mantenere la testa stadio a circa 45 ° rispetto all'asse orizzontale in quanto ciò garantisce un angolo di entrata per la pipetta che è adatto per la formazione di elevata tenuta resistenzas sulla cella Mauthner.
4. Appena prima di entrare nella soluzione del bagno, applicare una piccola quantità di pressione positiva alla pipetta per ridurre il rischio di sporcare la punta. Durante la registrazione mEPSCs, soluzioni da bagno includono 1 micron TTX per bloccare potenziali d'azione, 5 micron stricnina per bloccare i recettori della glicina e 10 micron bicucullina o 100 micron picrotossina di bloccare i recettori GABA _A. Durante la registrazione mIPSCs, soluzioni da bagno includono 1 micron TTX, acido kynurenic e sia bicucullina o stricnina a seconda dell'attività del recettore di interesse.
5. Avvicinarsi alla cellula M con una piccola quantità di pressione positiva nella pipetta. La pressione positiva spinge delicatamente la cella da un lato all'altro e quando posizionato immediatamente sopra la cella, forma una piccola fossetta sulla membrana cellulare. Lasciare la pipetta in posizione per alcuni secondi per pulire la superficie cellulare in modo che una forte tenuta tra la pipetta e la membrana può essere formata. Rilasciando la pressione positiva nella pipettaconsente la guarnizione deve essere iniziato e una piccola quantità di pressione negativa accoppiata con potenzialità pipetta negativi provoca guarnizioni GigaΩ formando in pochi secondi.
6. Cambiare la potenziale partecipazione sull'amplificatore a -60 mV. Rottura della membrana cellulare con una serie di brevi impulsi di aspirazione. Registrare immediatamente il potenziale di membrana e ridurre al minimo gli artefatti di capacità. Compensare capacità della cella (C _m) e l'accesso (serie) resistenza (R _a) dal 70-85%. R _A dovrebbe essere regolarmente verificato, ogni 30 secondi ad un minuto, e se vi è un cambiamento di 20% o più, termina l'esperimento.
7. Una volta che l'esperimento è finito e abbastanza dati è stato acquisito, il preparato viene sacrificato rimuovendo hindbrain con un paio di pinze. A questo punto, l'analisi dei dati può iniziare.

Risultati

In questo manoscritto presentiamo un metodo per la registrazione patch-clamp in modalità whole-cell da neuroni reticulospinal in zebrafish, con particolare attenzione alla cellula M. Naturalmente, è anche possibile registrare in altri modi patch clamp come cella-attached, dentro-fuori e fuori fuori. Il tipo di dati che si possono ottenere non è limitato a quello che abbiamo qui presentato, ma cerchiamo di fornire un esempio di entrambi sinaptica (eccitatoria e inibitoria) in modalità voltage-clamp e potenziali di azione in current clamp. Con l'invecchiamento dell'organismo e le cellule M sviluppare più ampi ed elaborati dendriti, la capacità di tensione adeguatamente morsetto e spazio bloccare la cella viene compromessa e il modo pinza corrente diventa la registrazione di scelta.

Figura 3 mostra registrazioni rappresentativi delle correnti recettori eccitatori AMPA e NMDA ottenuti da 48 embrioni HPF in presenza di TTX (1 mM) e agenti farmacologicibloccare i recettori GABA e glicina. Quando le cellule M sono tensione serrato a -60 mV, le correnti sinaptiche sono dovute all'attivazione dei recettori AMPA (Figura 3A). Acquisizione e l'analisi di questi eventi permette di registrare parametri come tempo di salita, tempo di decadimento, ampiezza e frequenza. Eventi AMPA in genere hanno un tempo di salita veloce (20-80% tempo di salita di circa 0,1 msec) e tempo di decadimento (~ 0.5 msec), e mostrano una ampiezza media di circa 25 pA. Quando gli M-cellule sono bloccati a +40 mV, le conseguenti correnti esteriori sono dovuti a AMPA e NMDA attività del recettore (Figure 3C e 3D). Correnti del recettore NMDA presentano andamenti temporali più lunghi rispetto correnti del recettore AMPA, e devono essere registrate potenzialità positive o in soluzione Mg-libera per rimuovere il blocco di Mg del NMDA recettori ^2,6. Il mEPSC medio mostrato in Figura 3D rappresenta AMPA e NMDA correnti miste registrate a +40 mV.

Figura 4 mostra i risultati rappresentativi durante la registrazione mIPSCs dalle cellule Mauthner. Questi eventi si sono verificati in presenza di TTX (1 mM) e acido kynurenic (1 mM) per bloccare i recettori AMPA e NMDA. Questi eventi mostrano aumento ragionevolmente veloce e cinetica di decadimento per 48 HPF e sono abbastanza frequenti per acquisire molti di loro su una registrazione ³ min 2-3. Figura 5 mostra i potenziali di azione registrate per effetto di iniettare corrente depolarizzante nella cellula. M-cellule del 48 HPF embrioni di solito sparano un singolo potenziale d'azione (Figura 5B), anche se a volte sparano più punti di accesso quando iniettato con stimoli suprathreshold (Figura 5A).

	Abbreviazione	Nome e cognome
1.	MPSC	Corrente postsinaptica Miniature
2.	mEPSC	Miniature corrente postsinaptico eccitatorio
2	mIPSC	Miniature corrente postsinaptico inibitorio
3.	MW	Mega Ohm (unità di resistenza: 10 6 Ohm)
4.	GΩ	Giga Ohm (unità di resistenza; 10 9 Ohm)
4.	MOsm	Milli osmolar (unità di osmolarità, 10 -3 osmoles)
4.	TTX	tetrodotossina
5.	ATP	adenosina trifosfato
6.	GTP	guanosina trifosfato
7.	GFP	Proteina fluorescente verde

Tabella 1.

		Azienda	Numero di catalogo
1.	Dissezione Dish	Warner Instruments	64-0291
2.	0.001 "Tungsten Wire	Scientific Instruments Services Inc.	W406
2	Microscopio da dissezione	Leica Microsystems	MZ9.5
3.	Pipetta Puller	Sutter Instruments Co.	P-97
4.	Microforge	Narishige Group	MF-900
5.	Montante microscopio morsetto Patch	Leica Microsystems	DMLFSA
6.	Micromanipolatore	Siskiyou Inc.	MX7500
7.	Digidata	Molecular Devices	1322A
8.	Amplificatore	Molecular Devices	200B
9.	Software di acquisizione	Molecular Devices	pClamp9
10.	Axograph X	Axograph	Axograph X

Tabella 2.

	Soluzione Nome	Reagente e concentrazione (mm)
1.	Dissezione soluzione	134 NaCl, 2.9 KCl, CaCl 2 2.1, 1.2 MgCl 2, 10, 10 HEPES glucosio e 0,02% Tricaine
2.	Soluzione MPSC extracellulare	134 NaCl, 2.9 KCl, CaCl 2 2.1, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 glucosio e 0.001 TTX
3.	MPSC intracellulare soluzionezione	134 CsCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2 ATP, 0,4 Li-GTP
4.	Azione potenziale soluzione extracellulare	137 NaCl, 2.9 KCl, CaCl 2 2.1, 1.2 MgCl 2, 10 e 10 HEPES glucosio (con 10 mM D-tubocurarina)
5.	Azione potenziale soluzione intracellulare	130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4mg-ATP e 0,4 Li-GTP.

Tabella 3. Tutte le soluzioni extracellulari vengono regolate a 290 mOsm e pH 7,8. Tutte le soluzioni intracellulari vengono regolate a 280 mOsm e pH 7,4.

Figura 1. Dissezione piatto e intatto preparazione midollo hindbrain-spinale. (A) dissezione e registrazione piatto ottenuto da WPI. Una rondella sottile è accuratamente sigillata su tegli vetrino sul fondo del piatto e Sylgard viene applicato al bene. (B) 48 HPF hindbrain-midollo spinale preparazione. La superficie ventrale del cervello posteriore rivolto verso l'alto e la cellula M si trova appena sotto la superficie del tessuto a livello della punta della freccia.

Figura 2. (A) immagine di contrasto di interferenza differenziale Nomarski di una cellula M ottenute da un embrione 2 dpf poco dopo la schiusa. L'immagine è stata scattata dopo la registrazione spontanea attività sinaptica eccitatoria da cellule M. (B) La cella è stata riempita con Lucifero giallo durante la l'esperimento. Adattato da ¹² con permesso.

Figura 3. (A) mEPSCs AMPA spontanee registrate da una cellula M ad un potenziale di -60 mV. (B) mEPSCs medi ottenuti dalla registrazione in (A). (C) spontanea AMPA e NMDA (frecce) mEPSCs registrati da una cellula M ad un potenziale di +40 mV. (D) mEPSCs medi ottenuti dalla registrazione in (C). MEPSCs glutammato sono stati registrati in presenza di TTX (1 micron) per bloccare potenziali di azione, stricnina (5 micron) e picrotossina (100 micron) per bloccare glicina e GABA correnti.

Figura 4. (A) mIPSCs spontanee registrati da una cellula M ad un potenziale di -60 mV. (B) mEPSCs medi ottenuti dalla registrazione in (A). mIPSCs stati registrati in presenza di TTX (1 mM) per bloccare potenziali d'azione, acido kynurenic (1 mM) per bloccare l'attività del recettore glutammato e bicucullina (10 pM) per bloccare le correnti GABA.

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Figura 5. Potenziali d'azione registrati da una cellula-M. In questa cella particolare uno stimolo suprathreshold (0.48 nA) ha indicato diversi potenziali d'azione (A), ma uno stimolo alla soglia risultati soltanto alla produzione di un singolo potenziale d'azione (B). (C) i protocolli attuali per le tracce indicate in A e B.

Discussione

Il protocollo sopra descritto permette di patch del record morsetto da M-cellule e suoi omologhi. La tecnica è impegnativo e la cura dovrebbe essere presa in diversi settori chiave durante tutta la procedura. Ora discuteremo alcune di queste aree e offrire suggerimenti utili per garantire il successo.

Costruzione della camera di dissezione / registrazione è un aspetto critico dell'esperimento. L'M-cellule sono difficili da vedere se non viene utilizzato il contrasto di interferenza differenziale. Nomarski DIC funziona meglio con vetrini pulito, ma abbiamo trovato che uno strato molto sottile di Sylgard (~ 1-2 mm) non distorcere il DIC a tal punto che interferisce con l'identificazione delle M-cellule. Pertanto, si usa una camera di registrazione che ha un vetrino di vetro sottile sul fondo su cui viene applicato un piccolo rondella di plastica (~ 5 mm di diametro). Mescoliamo Sylgard 184 in una capsula di Petri e aggiungere cautamente Sylgard liquido all'interno della rondella con una pipetta Pasteur. La Sylgard può essere curata a temperatura ambiente per un paio di giorni o può essere riscaldato per la rapida polimerizzazione. La rondella può essere rimosso dopo l'Sylgard è indurita, anche se questo non è necessario. Una volta effettuata la camera di dissezione / registrazione, può essere utilizzato per diverse settimane prima che sia necessario un nuovo Sylgard rivestita di vetro scorrevole.

Il passo successivo della procedura è di recuperare tutte le soluzioni pertinenti sul giorno dell'esperimento (Tabella 3). Soluzioni intracellulari contenenti tutto ma ATP e GTP sono anticipati e conservati in 5 ml aliquote a -20 ° C. Il giorno di registrazione un'aliquota è scongelata a temperatura ambiente e ATP fresco e viene aggiunto GTP. La soluzione viene regolato a 280 mOsm e pH 7,4. Nelle nostre mani, troviamo che l'aggiunta di ATP fresco e GTP su un quotidiano risultati di base in buone registrazioni. Tutte le soluzioni devono essere conservati sterile per la migliore possibilità di successo.

Le soluzioni intracellulari devono essere filtrati througah 0,22 micron filtro (Sigma) per rimuovere piccole particelle e detriti che potrebbero influenzare la registrazione. Per fare questo, dobbiamo prima disegnare la soluzione intracellulare in una siringa da 1 ml, applicare il filtro alla fine della siringa e aggiungere una punta della pipetta di plastica che era riscaldata e tirato a punta fine, fino alla fine del filtro. Ciò ci permette di applicare la soluzione intracellulare filtrata direttamente all'interno delle pipette patch di vetro.

Una volta che le soluzioni sono preparate, l'embrione può essere anestetizzato e sezionato. Prima della dissezione, occorre prestare attenzione per valutare adeguatamente l'età dell'organismo. Ogni embrione all'interno di un età frizione ad un tasso leggermente diversa. Pertanto nel valutare l'età dell'organismo è importante farlo secondo procedure stabilite ^10,13, utilizzando i riferimenti fenotipici quali il numero di somiti, la forma complessiva del corpo e il tempo di fecondazione dell'uovo. Tutte le dissezioni sono eseguite con una Dumont # 5 bel paio dipinze. Questi devono essere forte e in buone condizioni altrimenti sarà molto difficile da rimuovere la pelle sovrapponendo hindbrain e qualsiasi tessuto connettivo sulla superficie ventrale del cervello posteriore. Spesso dobbiamo affinare le pinze dopo poche settimane di utilizzo, e farlo noi stessi con una pietra affilatura.

Per bloccare il pesce per il sottile strato di sylgard, usiamo spilli modellati dalla sottile filo di tungsteno 0,001 pollici di diametro. I perni sono tagliate con un vecchio, forbici micro-dissezione sotto un microscopio da dissezione, e sono abbastanza piccolo da stare a destra attraverso la notocorda. Pinning gli embrioni in qualsiasi altro punto non immobilizzare le dissezioni e rende quasi impossibile da eseguire. Quando prima imparare effettuare le registrazioni, può essere difficile all'identità M-cella da suoi omologhi (particolarmente MiD2 cm, che si trova nella rhombomere vicina - rhombomere 5). In alcuni embrioni queste due coppie di celle appaiono di dimensioni simili. Il otoliti pronire un punto di riferimento comodo per facilitare l'identificazione delle cellule M. Al 48 HPF le cellule M sono situati direttamente ai otoliti, e anche se i otoliti vengono rimossi durante la dissezione, essi lasciano una zona laterale leggermente danneggiato del hindbrain, che serve come un marcatore per la loro posizione originale. Pesci transgenici che esprimono GFP o qualche altro marcatore fluorescente in cellule M, offrono eccellenti preparativi per i nuovi sperimentatori. Nelle nostre mani le cellule M hanno una capacità di membrana di circa 18-24 pF a 48 HPF, mentre gli omologhi più piccoli sono più vicini al 12-14 pF. Celle con maggiore superficie hanno grandi valori di capacità di membrana (misurato in Farad Pico (PF)) rispetto alle celle più piccole. Così, capacità di membrana può essere utilizzato come un indicatore approssimativo della dimensione cellulare, in cui le cellule più grandi hanno valori di capacità più grandi. Questa caratteristica elettrofisiologica serve come un'altra proprietà per cui la cellula M può essere identificato dai suoi omologhi. Infine, usiamo spesso LuCifer giallo nella nostra soluzioni (intracellulari), che ci permette di condurre una ditta di individuazione del tipo di cellula in esame con imaging di fluorescenza una volta le registrazioni sono complete di registrazione.

Resistenze punta della pipetta nel range di 3,5-4,5 mW sono il miglior compromesso tra dimensioni della punta e bassa resistenza di accesso, che varia tipicamente tra 8 e 15 mW. Ciò è particolarmente importante per gli eventi con cinetica veloce; ~ 0,1 msec (20-80%) aumentano volte e ~ 0,5 msec decadimenti esponenziali ^12,14,15 (Figure 3A e 3B). Dati sono acquisiti a un tasso digitalizzazione di 50-100 kHz e filtrato con una bassa frequenza di passaggio di 5-10 KHz. Per quanto riguarda le pipette di patch, abbiamo trovato che non hanno bisogno di essere lucidati a fuoco per ottenere una registrazione, ma anecdotally, sembra offrire leggermente migliore possibilità di ottenere buone guarnizioni rispetto pipette non lucidate. Dal momento che i puntali delle pipette sono relativamente grandi, noi non aggiungiamo very pressione molto positiva alla pipetta prima di entrare nella soluzione. Ci vuole pratica decidere la giusta quantità di pressione positiva di applicare come un eccesso di pressione si sposta la cella troppo, e impedirà la formazione di sigillo. Essa può anche danneggiare contatti sinaptici come la cella viene delicatamente spostato dalla sua posizione originale. D'altra parte, troppo poco risultati pressione in consigli sporchi e non pulisce la superficie della cellula abbastanza bene per formare buone guarnizioni. Una via di mezzo si ottiene solo con la pratica e l'esperienza significativa. Formazione sigillo può essere migliorata con applicazioni di tensioni negative alla pipetta. Noi di solito abbiamo sigilli di 1,2-2 GΩ, che sono eccellenti per le innovazioni nella modalità a cellula intera.

Quando agenti farmacologici devono essere applicati al citoplasma cellulare, li includiamo nella soluzione intracellulare prima del riempimento della pipetta. Si deve prestare attenzione durante la preparazione delle soluzioni pipetta per evitare la perdita degli agentifacendolo legano al filtro di 0,22 micron. Pertanto, filtriamo il mezzo intracellulare prima, e poi aggiungere con cautela l'agente farmacologico alla soluzione filtrata. Applicazione di composti al compartimento intracellulare ha una propria serie unica di sfide. Per esempio, aggiunta di farmaci al mezzo intracellulare solito riduce le probabilità di formare un sigillo GΩ, ma non al punto dove è un notevole ostacolo per l'esperimento.

Si dovrebbe comprendere che l'applicazione di agenti farmacologici in questo modo non permette lo sperimentatore per registrare il controllo più adeguato in quanto l'agente ha accesso immediato alla cella dall'inizio della configurazione di cellula intera. Pertanto, mentre registriamo i dati in questo tipo di esperimento, si deve essere consapevoli che il prossimo controllo migliore è l'applicazione intracellulare di una forma inattiva dell'agente. In molti casi questa assume la forma di un composto inattivato al calore, un peptide o criptator un isomero attivo ottenuto dal fornitore.

Noi acquistiamo i dati in forma di correnti sinaptiche (MPSCS), correnti voltaggio-dipendenti e potenziali d'azione. Correnti in miniatura possono essere analizzati da un paio di ottimi programmi (PClamp, Axograph, ecc), anche se noi preferiamo usare Axograph X (John Clements). Axograph X gira su entrambe le piattaforme Windows e Macintosh e può essere utilizzato sia per l'acquisizione e l'analisi dei dati elettrofisiologici. mEPCs vengono acquisiti con l'ausilio di un modello di scelta dello sperimentatore, ottenuto dalla registrazione stessa. Singoli eventi possono essere analizzati per le proprietà come tempo di salita, l'ampiezza, la metà di larghezza e degrado del tempo, ecc Esportiamo il foglio di dati Kaleidagraph (Synergy Software) dove possiamo produrre figure, tra cui copie di tracce di eventi da Axograph X.

Uno degli aspetti più difficili della dell'esperimento è determinare se la registrazione è stata eseguita abbastanza bene per fornire pulito,dati affidabili. Ad esempio, possono sorgere problemi di spazio bloccaggio durante la registrazione di MPSCS dalla M-cellule che hanno grandi assoni e ampi processi dendritiche. Quando la tensione di bloccaggio, si può generalmente controllare la tensione sulla punta della pipetta ragionevolmente bene (soprattutto se la resistenza di accesso (R _a) è bassa), ma non può avere un adeguato controllo del potenziale di membrana in processi dendritici o assoni che sono molto lontano dalla punta della pipetta. Un metodo per determinare se la cella è stata adeguatamente spazio serrato è di produrre un diagramma a dispersione del tempo di salita vs l'ampiezza delle MPSCS che sono stati registrati. Una correlazione tra i dati è indicativa di spazio insufficiente serraggio. In altre parole, se il morsetto spazio è scarso allora MPSCS che si verificano in prossimità della pipetta avranno volte più veloce e maggiori ampiezze di eventi che si verificano una certa distanza dalla pipetta fanno. Se una correlazione esiste, allora i dati è problematico e non può essere utilizzato.

Un altro aspettodi registrazioni elettrofisiologiche che deve essere affrontato è quello delle correnti di fuga. Ciò è particolarmente vero quando la tensione di serraggio una cella per registrare correnti voltaggio-dipendenti quali Na ⁺ o K ⁺ correnti. Quando il potenziale di membrana viene deviato dal resto, correnti di fuga possono essere registrati con attività voltaggio-dipendenti. Correnti di fuga (I _L), una combinazione di potassio _(K I), sodio (I _Na) e cloruro (I _Cl) corrente attraverso i canali non-voltaggio-dipendenti potranno oscurare l'attività di interesse e devono essere sottratti dalla registrazione. L'amplificatore è in grado di svolgere questa funzione in linea durante la registrazione eseguendo quello che viene tipicamente chiamato un protocollo P / N. Durante un protocollo P / N l'amplificatore verrà eseguito diversi piccoli depolarizzazioni (o hyperpolarizations) da fermo e registrerà l'attuale perdita risultante che si verifica. E 'importante utilizzare piccoli abbastanza impulsi che non attivano canali voltaggio-dipendenti. L'attuales che si verificano durante questi impulsi vengono registrati e una media in modo che queste correnti di fuga possono essere sottratti dalla attività dei canali voltaggio-dipendenti.

Infine, bisogna tener conto del potenziale di giunzione, che si verifica sulla punta dell'elettrodo tra intracellulari ed extracellulari soluzioni. Le soluzioni intracellulari ed extracellulari sono in genere composti da diversi ioni, con attività diverse e mobilità. Ioni più grandi con mobilità inferiore offrirà una maggiore resistività al movimento di ioni di quelli piccoli e questo può portare a una piccola ma significativa differenza di potenziale a livello della giunzione delle soluzioni. Questo potenziale di giunzione deve essere preso in considerazione per determinare le tensioni appropriate incontrate dalla cella.

La tecnica qui presentata è quello usato dal nostro laboratorio per molti anni. Tuttavia, ci sono metodi alternativi per la registrazione della cellula M. Più in particolare, Joseph Fetcho e colleghi hanno sviluppareed una preparazione eccellente in cui si può registrare dagli M-cellule di larve di età superiore (4-5 giorni) in maniera meno invasiva rispetto a quella presentata qui, dove la cellula M viene avvicinato dalla superficie dorsale ^16. Avevamo cercato una tecnica simile ma trovato più facile avvicinarsi al-cellula M dal lato ventrale del cervello posteriore, in cui la cellula è più vicino alla superficie del cervello, in particolare novellame (cioè 24 HPF a 72 HPF). Inoltre, un approccio dalla superficie dorsale solitamente necessario l'utilizzo di una linea transgenica che esprime un tag fluorescente in cellule M, che ha il potenziale di introdurre ulteriori variabili nella registrazione. Questo problema non è presente quando si utilizza tipo di pesce selvatico. Tuttavia, con la tecnica qui presentata, ci siamo limitati a studiare gli animali più giovani (24 HPF a 72 HPF). Così, ogni approccio ha i suoi vantaggi e limitazioni.

T-test di Student può essere utilizzata per confrontare due gruppi di dati, mentre una analisi di Variance (ANOVA) può essere utilizzata per confrontare più gruppi. Bisogna fare attenzione a scegliere il test post-hoc appropriato per parametrica vs dati non parametrici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatto di dissezione	Warner Instruments	64-0291
0.001" Filo di tungsteno	Scientific Instruments Services Inc.	W406
Microscopio da dissezione	Leica Microsystems	MZ9.5
Estrattore per pipette	Sutter Instruments Co.	P-97
Microforge	Narishige Group	MF-900
Microscopio a pinza verticale	Leica Microsystems	DMLFSA
Micromanipolatore	Siskiyou Inc.	MX7500
Digidata	Molecular Devices	1322A
Amplificatore	Molecular Devices	200B
Software di acquisizione	Molecular Devices	pClamp9
Assografo X	Assografo	Sassografo X