Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Sommario

In questo studio, lo scopo principale era monitorare l'assorbimento cellulare e l'eventuale esocitosi dei nanotubi di carbonio (CNT). Da questo punto di vista, abbiamo proposto un metodo unico che utilizza la citometria a flusso con imaging multispettrale che consente una quantificazione e localizzazione di CNT in un numero statisticamente rilevante di cellule.

Abstract

I nanomateriali a base di carbonio, come i nanotubi di carbonio (CNT), appartengono a questo tipo di nanoparticelle che sono molto difficili da discriminare dalle strutture cellulari ricche di carbonio e di fatto non esiste ancora un metodo quantitativo per valutare la loro distribuzione a livello di cellule e tessuti. Quello che proponiamo qui è un metodo innovativo che consente la rilevazione e la quantificazione di CNT nelle cellule utilizzando un citometro a flusso multispettrale (ImageStream, Amnis). Questo dispositivo di nuova concezione integra sia un'elevata produttività di cellule che immagini ad alta risoluzione, fornendo così immagini per ogni cellula direttamente nel flusso e quindi un'analisi delle immagini statisticamente rilevante. Ogni immagine cellulare viene acquisita su canali in campo chiaro (BF), campo scuro (DF) e fluorescenti, dando accesso rispettivamente al livello e alla distribuzione dell'assorbimento della luce, della luce diffusa e della fluorescenza per ciascuna cella. L'analisi consiste quindi in un confronto pixel per pixel di ogni immagine, delle 7.000-10.000 cellule acquisite per ogni condizione dell'esperimento. La localizzazione e la quantificazione dei CNT è resa possibile grazie ad alcune particolari proprietà intrinseche dei CNT: forte assorbanza e diffusione della luce; infatti i CNT appaiono come macchie scure fortemente assorbite su BF e macchie luminose su FD con una precisa colocalizzazione.

Questa metodologia potrebbe avere un impatto considerevole sugli studi sulle interazioni tra nanomateriali e cellule, dato che questo protocollo è applicabile per una vasta gamma di nanomateriali, nella misura in cui sono in grado di assorbire (e/o diffondere) la luce con sufficiente forza.

Introduzione

Durante gli ultimi decenni, il ruolo delle nanoparticelle ha acquisito importanza in una vasta gamma di applicazioni. In particolare, i nanotubi di carbonio (CNT) sono sempre più esplorati come nanostrumenti per diverse applicazioni diagnostiche e terapeutiche; grazie alle loro particolari proprietà elettriche, termiche e spettroscopiche, i CNT possono fungere da veicoli di rilascio per vari farmaci o agenti di contrasto, o possono anche essere coinvolti nell'ingegneria tissutale¹.

Tuttavia, le preoccupazioni sulla potenziale tossicità di tali nanomateriali sono ancora oggetto di dibattito, principalmente perché il destino dei CNT nell'organismo rimane molto controverso. C'è infatti una mancanza di metodi appropriati per rilevarli e quantificarli in cellule e tessuti vivi: ad esempio, sono state suggerite tecniche come la spettroscopia Raman, la fotoacustica e l'imaging in fotoluminescenza nel vicino infrarosso, ma ogni metodo mostra limitazioni a seconda del tipo di nanotubi e/o del loro ambiente^2-8.

Qui, il metodo proposto potrebbe essere applicabile per il rilevamento e la quantificazione di nanoparticelle nelle cellule. Ciò è stato reso possibile dall'uso di ImageStream, un dispositivo che combina citometria a flusso e imaging ad alta risoluzione. Combina i vantaggi dell'acquisizione di un'ampia gamma di celle (fino a 5000 eventi/sec) e i vantaggi dei dati statistici e delle immagini ad alta risoluzione di ciascuna cella allo stesso tempo (risoluzione spaziale di 0,5 μm). Generalmente, le immagini vengono raccolte utilizzando una telecamera CCD e sono una rappresentazione bidimensionale in scala di grigi della cellula. La luce viene quantificata per ogni pixel dell'immagine e identifica sia l'intensità che la posizione della fluorescenza o dei componenti con una dimensione subcellulare (ad esempio in BF), consentendo così una potente capacità di discriminare le cellule in base al loro aspetto^9,10.

L'obiettivo era quello di progettare un metodo di nanometrologia che consentisse una valutazione quantitativa della distribuzione e del comportamento dei CNT nelle cellule. In particolare, questo metodo è stato sviluppato per studiare l'assorbimento cellulare, l'elaborazione e l'esocitosi dei CNT da parte delle cellule. Abbiamo evidenziato in primo luogo il complesso traffico cellulare dei CNT e in secondo luogo il trasferimento di questi nanomateriali tra le cellule: i CNT internalizzati dalle cellule fuoriescono dalle loro cellule ospiti quando stressati, si diffondono nello spazio extracellulare e vengono reinternalizzati da cellule naïve, siano esse omotipiche o eterotipiche¹¹

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Studio precedente ha dimostrato che diversi meccanismi di assorbimento cellulare, attivi o passivi, potrebbero verificarsi a seconda della funzionalizzazione dei CNT e dello stato di aggregazione¹². Qui i CNT a parete multipla sono stati funzionalizzati attraverso cicloaddizione 1,3-dipolare e ammidazione e poi derivatizzati con una sonda fluorescente, fluorescenza in isotiocianato (FITC). Al microscopio elettronico a trasmissione, sembrano essere internalizzati dalle cellule individualmente con localizzazione citosolica o come fasci, per lo più presenti nei compartimenti endosomiale e lisosomiale¹¹. Su ImageStream, i CNT raggruppati appaiono con un'alta correlazione come macchie scure su BF e macchie luminose su DF, consentendo una chiara distinzione tra cellule marcate con CNT e cellule di controllo. D'altra parte, la distribuzione del segnale fluorescente emesso dal marcatore fluorescente funzionalizzato con CNT non era altrettanto ben colocalizzata: infatti, probabilmente a causa di un fenomeno di quenching, le macchie fluorescenti verdi non corrispondono necessariamente alle macchie su BF e DF. Ciò indica che, in primo luogo, una sonda fluorescente non è obbligatoria per la rilevazione di CNT con ImageStream e, in secondo luogo, a maggior ragione, che non è completamente rappresentativa sia per la quantificazione che per la localizzazione dei CNT.

Oltre a fornire una quantificazione statistica relativa delle nanoparticelle, questo metodo fornisce anche informazioni riguardanti la localizzazione dei CNT nelle cellule, il che significa che discrimina, ad esempio, i CNT all'interno della cellula rispetto a quelli che sono legati alla membrana plasmatica. La capacità di localizzare i CNT sulle immagini cellulari supera chiaramente i limiti dell'analisi convenzionale della citometria a flusso¹³. La procedura è stata sviluppata attraverso la creazione di maschere che si adattano a specifiche regioni della cellula e selezionano anche le macchie scure corrispondenti ai CNT caricati.

In generale, questo metodo potrebbe essere applicato per una vasta gamma di esperimenti che coinvolgono la necessità di visualizzazione, o quantificazione, nelle cellule, a condizione che le nanoparticelle utilizzate siano in grado di assorbire fortemente (e/o disperdere) la luce.

Protocollo

1. Preparazione di nanotubi di carbonio (CNT) dispersibili in acqua

1. Disperdere i primi CNT nell'acqua di coltura cellulare, prima di sonicarli per 20 minuti in un sonicatore in acqua di bagno a 20 °C. Se i CNT vengono funzionalizzati con una sonda fluorescente, proteggerli il più possibile dalla luce durante l'esperimento.

2. Etichettare le celle con i CNT

1. Far crescere cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) (ad esempio) su piastre di 25 cm² in terreno DMEM, contenenti il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina streptomicina.
2. Preparare soluzioni di CNT a concentrazioni di 0, 10, 20 e 50 μg/ml in terreno completo e incubare le cellule a 37 °C per 20 ore o a 4 °C per 20 ore (2 ml di sospensione di CNT per una piastra da 25 cm²).

3. Fissazione cellulare

1. Rimuovere successivamente il terreno di incubazione; sciacquare le cellule con PBS, tripsinizzare e risospendere le cellule in un terreno DMEM completo. Centrifugare per 5 minuti a 1.200 giri/min.
2. Sostituire il terreno prima con paraformaldeide al 4% per 1 ora a 4 °C, poi con PBS per preservarli. Se necessario, le cellule possono essere conservate in questa fase del processo a 4 °C per diversi giorni fino all'analisi citometrica.
3. Ogni campione deve contenere circa 10-6 cellule concentrate in 50 μl di PBS. Sospenderli correttamente per evitare aggregati durante l'analisi e filtrarli attraverso un coloratore a rete da 50 μm.
   Nota: Ogni passaggio deve essere eseguito molto delicatamente per preservare le cellule.

4. Acquisizione ImageStream

Usa il citometro a flusso multispettrale ImageStream per acquisire immagini di cellule.
Alcuni punti devono essere rispettati:

1. Selezionare un ingrandimento adattato (in questo caso viene utilizzato un obiettivo 40X).
2. Se si utilizzano fluorocromi:
   - Preparare un campione di controllo senza fluorocromo.
   - Preparare le celle con un controllo positivo monocolore per ogni fluorocromo utilizzato in
   aggiunta ai tuoi campioni.
3. Utilizzare il laser a 488 nm per eccitare il FITC e il canale 02 per raccogliere l'emissione di fluorescenza (passa-banda 480-560 nm). Inoltre, utilizzare anche i canali 01 e 06 rispettivamente per il campo chiaro (BF) e il campo scuro (DF).

5. Post Elaborazione - Software di Analisi IDEAS (Versione 4.0)

1. Tra tutti gli eventi acquisiti, l'analisi deve essere prima ristretta alla popolazione di singole celle: utilizzare un grafico a punti biparametrico che rappresenta il 'rapporto d'aspetto' (cioè larghezza/altezza) rispetto all''area della cella' (parametri applicati alle celle su BF) (Figura 1). Le singole cellule incluse nella regione di interesse con un'area standard e un rapporto di aspetto vicino a 1 vengono quindi discriminate dagli eventi multicellulari (area grande e rapporto di aspetto piccolo) e dai detriti (area estremamente piccola).
2. Per selezionare le celle nel piano focalizzato, utilizzare un grafico a punti biparametrico adattato per celle marcate con CNT ad alto contrasto: tracciare il "contrasto" rispetto al "gradiente RMS" (che misura la qualità della nitidezza di un'immagine) sull'immagine BF - consente l'esclusione di celle non focalizzate che mostrano sia un basso gradiente rms che un basso contrasto nelle loro immagini BF (Figura 1).
3. 1. Determinare il parametro che fornisce la migliore separazione statistica tra celle etichettate e non etichettate utilizzando la funzione "trova la funzione migliore". Nel nostro studio, la funzione dell'oggetto pixel medio è il parametro più adatto (Figura 2).
   2. Tracciare un istogramma utilizzando questo parametro rispetto alla frequenza normalizzata per confrontare la quantità di CNT assorbiti per le concentrazioni testate (Figura 3).
   3. Tracciare il grafico biparametrico 'mean pixel object on BF' (Notation: Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) rispetto a 'intensity on DF'(Intensity_MC_Ch06), al fine di studiare la correlazione tra questi due parametri (Figura 4).
4. La quantificazione viene valutata anche mediante mascherine:
   1. Poiché i CNT appaiono come macchie scure fortemente assorbenti su BF, creare prima una maschera di soglia che si adatti esattamente ad essi selezionando un intervallo ristretto di pixel con una bassa intensità compresa tra 0 e 533 in questo studio (Maschera 1, notazione: Intensità (M01, BF, 0-533)) (Figura 5). La scelta dell'intensità di soglia viene effettuata sulle celle marcate rispetto alle celle di controllo.
   2. Al contrario, creare anche una maschera che si adatti con i pixel di alta intensità (150-4095 in questo caso) del DF (Maschera 2, notazione: Intensità (M06, DF, 150-4095)) (Figura 6).
   3. Tracciare un grafico utilizzando l'area della maschera (1 o 2; (notazione: Area_Intensity(M01, BF, 0-533)per la maschera 1): fornirà una quantificazione relativa dell'internalizzazione dei CNT a diverse concentrazioni (Figura 7).
   4. Verificare il grado di correlazione tra queste due maschere (grazie al grafico biparametrico 'area della Maschera 1' rispetto ad 'area della Maschera 2') (Figura 7).
5. Creare altre maschere per localizzare i CNT nelle cellule:
   1. Una maschera che si adatta all'interno della cellula: Erode(M01, 7) - corrispondente alla maschera dell'intera cellula (M01) (Figura 8), che viene ulteriormente erosa di 7 pixel (Figura 9).
   2. Una maschera che si adatta alla membrana utilizzando solo l'equazione booleana: M01 e non Erode(M01,7) - maschera dell'intera cellula (M01) sottratta dall'interno (Erode(M01,7)) (Figura 10).
   3. Per considerare i pixel scuri sulla membrana (corrispondenti ai CNT), creare quindi la maschera: Intensità(M01 e non Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Figura 11).
   4. Visualizza le diverse maschere applicate su una raccolta di celle per verificarne la rilevanza (Figura 12) per le celle etichettate e non etichettate.
   5. Applicare l'area caratteristica sulla maschera selezionando i pixel neri sulla membrana 'Area_Intensità (M01 e non Erode(M01, 7), BF, 0-533)' cosiddetta area nera. Permetterà la quantificazione dei CNT sulla membrana.
      
      Per discriminare infine i CNT che sono stati internalizzati da quelli adsorbiti solo sulla membrana, tracciare l'area nera sulla membrana rispetto all'area nera sull'intera cellula (cioè 'Intensità Area_ (M01 e non Erode(M01, 7), BF, 0-533' contro 'Intensità Area_ (M01, BF, 0-533)').
      
      nota: Lo stesso tipo di procedura viene applicata con il segnale fluorescente FITC: confrontare l'aumento dell'intensità della fluorescenza FITC rispetto alla diminuzione del segnale pixel medio sul BF, o la colocalizzazione tra macchie scure su BF e intensità di fluorescenza FITC. Nel nostro caso, questo tipo di analisi non è rilevante perché il segnale di fluorescenza non corrisponde correttamente con le macchie scure su BF da un lato e con il campo chiaro su DF dall'altro, dimostrando che le proprietà intrinseche dei CNT (assorbanza e diffusione della luce) sono più appropriate del segnale relativo alla sonda di fluorescenza.
6. Una volta creati tutti i grafici in una condizione sperimentale, creare un "modello di report statistico", salvare il modello come file .ast e raggruppare tutti i file di dati.

Risultati

Una panoramica del principio del dispositivo ImageStream è mostrata nella Figura 1. Esso produce molteplici immagini ad alta risoluzione di ogni cellula in flusso, incluse quelle in campo chiaro (BF), in campo scuro (DF o luce laterale dispersa) e nei canali di fluorescenza, come illustrato nella Figura 2 con tre cellule diverse marcate con CNT. Sono mostrati anche gli overlay di questi canali, che a prima vista illustrano la correlazione.

Poiché tutta l'analisi di post-elaborazione si basa sull'immagine cellulare, la selezione delle cellule a fuoco è cruciale per lo studio (Figura 3). In effetti, la presenza di CNT induce variazioni sia nel contrasto che nel gradiente rispetto alle cellule non marcate: le cellule a fuoco, che hanno internalizzato una quantità significativa di CNT, tendono ad avere un gradiente rms basso (che di solito è l'unico parametro utilizzato per discriminare tra cellule a fuoco versus non a fuoco), ma anche un contrasto elevato, spiegando perché un grafico biparametrico è essenziale. Nella Figura 3 è mostrata la discriminazione tra cellule non a fuoco (area gialla) versus cellule a fuoco (area blu).

I CNT internalizzati dalle cellule sono chiaramente distinguibili, in particolare in BF, dove appaiono come punti scuri fortemente assorbenti (vedere l'effetto di diverse concentrazioni di marcatura, Figura 4). Inoltre, è stato analizzato il segnale medio dei pixel in BF, ottenendo una quantificazione relativa dell'assorbimento: i grafici nella Figura 5 mostrano un aumento significativo all'aumentare della concentrazione di marcatura dei CNT (risultati ottenuti con circa 7.000 cellule per condizione sperimentale).

In secondo luogo, la quantificazione dei CNT è possibile anche mediante l'uso di maschere, applicate o su un intervallo ristretto di pixel scuri del BF o sui pixel ad alta intensità del DF (vedi esempi in Figura 6), corrispondenti ai punti risultanti dalla presenza dei CNT. Pertanto, riportando su grafico l'area di queste maschere è possibile evidenziare anche l'aumento dell'assorbimento (illustrato in Figura 7 con l'area della maschera sul BF, selezionando pixel compresi tra 0-533).

Inoltre, la correlazione tra i punti su BF e DF può essere valutata tracciando l'intensità di DF in funzione del segnale medio dei pixel di BF (come in Figura 8) (analisi indipendente dalla maschera) oppure l'area della maschera su BF (Maschera 1) in funzione dell'area su DF (Maschera 2).

Per quanto riguarda la procedura sviluppata per la localizzazione dei CNT all'interno delle cellule, Figura 9A mostra le diverse maschere che sono state create. Si noti che la robustezza delle maschere di localizzazione (basate sull'erosione della maschera cellulare predefinita) deve essere verificata visivamente su un insieme di cellule etichettate e non etichettate. Le stesse maschere vengono utilizzate per tutti i campioni.

La rappresentazione dell'area totale delle macchie nere sulla membrana cellulare rispetto a quella su tutta la cellula fornisce un indice di internalizzazione per le cellule incubate per 20 ore a 37 °C in confronto all'incubazione di 2 ore a 4 °C (vedere Figura 9B); ciò indica che i CNT si trovano prevalentemente sulla membrana a 4 °C, mentre a 37 °C i CNT sono internalizzati in oltre il 90% delle cellule.

Infine, per quanto riguarda la fluorescenza, questo parametro non è stato utilizzato come indicatore per la quantificazione dei CNT a causa di una correlazione troppo bassa tra le macchie fluorescenti e quelle nel campo chiaro (e nel campo scuro). Infatti, la correlazione tra l'intensità di FITC e il valore medio dei pixel nel campo chiaro indica un coefficiente di correlazione di Pearson pari a -0,2. Nella Figura 10 sono illustrati due casi, in cui il segnale di fluorescenza corrisponde adeguatamente oppure no alla macchia nera nel campo chiaro.

Figura 1. Panoramica del funzionamento generale di ImageStream. Il sistema di imaging multispettrale acquisisce fino a 12 immagini/cella in tre modalità diverse: campo chiaro, campo scuro e fluorescenza. La configurazione comprende 5 laser di eccitazione, con lunghezze d'onda di 405, 488, 560 e 658 nm. La luce proveniente dalle cellule in flusso nella cuvetta viene raccolta mediante diversi obiettivi (in questo studio è stato utilizzato l'obiettivo 40X) e indirizzata all'elemento di decomposizione spettrale, costituito da un insieme di filtri passa-alto disposti in configurazione angolare. La fotocamera CCD che acquisisce le immagini cellulari opera mediante una tecnica chiamata integrazione temporale ritardata (time-delay-integration) per evitare il fenomeno dello streaking delle immagini. È disponibile l'opzione di profondità di campo estesa (EDF).

Figura 2. Galleria di immagini di cellule marcate con nanotubi di carbonio (50 μg/mL) acquisite mediante ImageStream attraverso diversi canali (campo chiaro (BF), campo scuro (DF), fluorescenza (FITC) e relative sovrapposizioni). I nanotubi di carbonio confinati all'interno dei lisosomi intracellulari appaiono come grandi punti neri nelle immagini a campo chiaro. Al contrario, generano punti luminosi nelle immagini a campo scuro e in quelle a fluorescenza.

Figura 3. Selezione delle cellule a fuoco. Un diagramma a dispersione bivariato che rappresenta il gradiente quadratico medio (rms) rispetto al contrasto nelle immagini in campo chiaro permette di escludere le cellule fuori fuoco. Nella figura, l'area gialla rappresenta le cellule fuori fuoco, mentre le cellule a fuoco sono indicate in blu. Le cellule fuori fuoco si caratterizzano per un basso contrasto e un basso valore di gradiente rms nell'immagine in campo chiaro. Oltre al gradiente rms, la caratteristica del contrasto è necessaria per discriminare le cellule a fuoco dopo la loro marcatura con nanotubi di carbonio (CNTs).

Figura 4. Assorbimento dipendente dalla dose di CNT visualizzato mediante ImageStream. Il numero e l'area delle macchie nere nelle immagini in campo chiaro aumentano con la dose di CNT durante l'incubazione con le cellule (da 0 a 50 µg/ml). Si noti che le cellule di controllo sono prive di macchie nere.

Figura 5. Quantificazione relativa dell'assorbimento di CNT basata sulle immagini in campo chiaro. Gli istogrammi della media delle caratteristiche dei pixel applicati alla maschera "oggetto", che rappresenta l'intera cellula, mostrano chiaramente un comportamento dipendente dalla dose, utilizzabile per la quantificazione. L'intervallo R9 comprende le cellule positive ai CNT.

Figura 6. Creazione di maschere per selezionare le macchie scure nelle immagini in campo chiaro e le macchie luminose in quelle in campo scuro. Poiché i nanotubi di carbonio (CNT) appaiono come macchie scure fortemente assorbenti nell'immagine in campo chiaro, viene creata una maschera con soglia per selezionare un intervallo ristretto di pixel con bassa intensità compresa tra 0-533 in questo studio (Maschera 1, notazione: Intensity(M01, BF, 0-533)). Al contrario, una maschera che seleziona i pixel ad alta intensità (150-4095 in questo caso) nell'immagine in campo scuro (Maschera 2, notazione: Intensity (M06, DF, 150-4095)) viene utilizzata per identificare le macchie luminose in campo scuro, corrispondenti a zone con elevata diffusione della luce.

Figura 7. L'assorbimento dose-dipendente dei CNT è dimostrato dalla quantificazione dell'area delle macchie nere nelle immagini BF. Applicando una maschera di soglia (mask 1) sull'immagine BF, è possibile quantificare l'area delle macchie nere per ogni cellula, mostrando una distribuzione dipendente dalla dose.

Figura 8. I metodi di quantificazione dei CNT basati su immagini in luce brillante (assorbimento) e in luce oscura (diffusione) sono correlati. A sinistra, valore medio dei pixel nell'immagine in campo chiaro contro intensità nell'immagine DF, mostrano una buona correlazione per le cellule marcate con CNT50 µg/ml) (coefficiente di correlazione di Pearson r = -0,68). A destra, area della maschera adattata alle macchie scure in BF contro area della maschera adattata ai punti luminosi in DF per cellule marcate con CNTs (50 µg/ml). Il coefficiente di correlazione di Pearson è r = -0,83. Sono riportati i valori di 7.000 cellule.

Figura 9. Localizzazione dei nanotubi di carbonio (CNT) nelle cellule mediante l'uso di maschere specifiche. (A) Vengono create maschere per adattarsi a una particolare localizzazione della cellula, da sinistra a destra: l'intera cellula, soltanto la membrana e l'interno della cellula. Un’altra maschera rileva le macchie nere grazie a una soglia di intensità (Maschera 1, notazione: Intensity(M01, BF, 0-533). (B) La valutazione della localizzazione dei CNT può essere ottenuta misurando l'area delle macchie nere in diverse localizzazioni cellulari, utilizzando le maschere di localizzazione descritte in A. L'incubazione con CNT (50 µg/ml) è stata eseguita sia a 37 °C che a 4 °C per inibire il percorso di internalizzazione. Il grafico che rappresenta l'area nera sulla membrana rispetto all'area nera sull'intera cellula mostra un'assorbimento dose-dipendente dei CNT sulla membrana a 4 °C, mentre l'internalizzazione completa dei CNT risulta efficace a 37 °C.

Figura 10. Colocalizzazione delle macchie nere indotte dai CNT su campo chiaro (BF) con macchie luminose fluorescenti nell'immagine FITC. Le macchie luminose fluorescenti non sono sempre colocalizzate con le macchie nere su campo chiaro. La corrispondenza è corretta per le prime due cellule mostrate, ma non per le ultime due cellule.

Discussione

1. Modifica e risoluzione dei problemi

In questo studio, il primo obiettivo è stato quello di valutare la quantità e la localizzazione dei CNT nelle cellule. La microscopia confocale avrebbe potuto essere a priori il metodo gold per valutare la distribuzione intracellulare dei CNT funzionalizzati con il marcatore fluorescente FITC^8,14. Tuttavia, lo svantaggio principale è la limitazione all'imaging di singole cellule e, quindi, la mancanza di dati statisticamente rilevanti. L'ImageStream consente di lavorare oltre questi ostacoli: infatti, eseguendo lo screening di un gran numero di cellule (5.000-10.000) in un breve tempo (

Rispetto alla citometria a flusso convenzionale, il vantaggio unico di ImageStream è quello di fornire immagini multispettrali di ciascuna cellula e un confronto pixel per pixel dell'intensità del segnale. Pertanto, ImageStream combina la potenza statistica della citometria a flusso ad alto rendimento con i vantaggi analitici dell'imaging confocale per ogni cellula analizzata. È fondamentale per una quantificazione e localizzazione relativa senza marcatura dei CNT nelle cellule.

2. Passaggi critici all'interno del protocollo

La fase critica consiste nella scelta dei parametri più adatti di ogni studio. Nel nostro caso, il modo migliore è stato quello di basare l'analisi sulle proprietà di assorbimento e scattering dei nanotubi: la buona correlazione tra la localizzazione delle macchie scure su BF e le macchie luminose su DF supporta che il metodo sviluppato è rilevante e affidabile - e potrebbe non essere stato possibile senza l'imaging cellulare.

3. Limiti della tecnica

Va sottolineato che la visualizzazione dei CNT nelle cellule è stata possibile solo perché tendono ad accumularsi nelle vescicole intracellulari endosomiali, per poi apparire come forti punti di assorbimento e dispersione. I singoli nanotubi non dovrebbero essere rilevati sulla base di questo metodo, mentre potrebbero essere eventualmente rilevati con la fluorescenza, il che costituisce una chiara limitazione. In secondo luogo, la quantificazione non è "assoluta" ma relativa per diverse concentrazioni di marcatura e rispetto alle cellule di controllo non marcate. Alcune caratteristiche quantitative (pixel medio, intensità, ecc.) sono parametri assoluti, mentre altre dipendono dalla scelta delle maschere (maschera di soglia, maschere di localizzazione).

4. Importanza rispetto ai metodi esistenti

Per quanto riguarda la fluorescenza, l'analisi di ImageStream evidenzia la scarsa colocalizzazione dei cluster di CNT tra il segnale luminoso FITC e le macchie sugli altri canali. Pertanto, sembra che la fluorescenza non fosse un indicatore affidabile per la quantificazione e la localizzazione dei CNT. Tuttavia, superando i limiti della citometria a flusso convenzionale, che si basa principalmente sulla quantificazione della fluorescenza, l'ImageStream multispettrale ad alto rendimento apre la strada a una quantificazione statistica senza marcatura , fornendo al contempo la localizzazione dei nanotubi di carbonio all'interno delle cellule.

5. Applicazioni future

Questo metodo di nanometrologia statistica ad alto rendimento potrebbe essere generalizzato a qualsiasi nanomateriale, che mostra un elevato assorbimento e dispersione della luce quando interagisce con le cellule. Pertanto, potrebbe avere importanti applicazioni per le indagini sulla nano-bio-interfaccia, la nanotossicologia e la nanomedicina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ImageStream	Amnis