I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

Summary

Descriviamo la preparazione di tre campioni e come possono essere utilizzati per ottimizzare e valutare le prestazioni dei microscopi tempesta. Utilizzando questi esempi vi mostriamo come acquisire dati grezzi e poi elaborarlo per acquisire immagini super-risoluzione in cellule di circa 30-50 nm risoluzione.

Abstract

STORM è una tecnica di microscopia super-risoluzione recentemente sviluppato con fino a 10 volte la risoluzione migliore di tecniche di microscopia a fluorescenza standard. Tuttavia, poiché l'immagine viene acquisita in modo molto diverso rispetto al normale, costruendo una molecola per molecola immagine, ci sono alcune sfide significative per utenti in cerca di ottimizzare il loro acquisizione dell'immagine. Per aiutare questo processo e ottenere un quadro più chiaro di come funziona STORM presentiamo la preparazione di 3 campioni di prova e la metodologia di acquisizione ed elaborazione STORM immagini super-risoluzione con risoluzioni tipiche di 30-50 nm. Combinando i campioni di prova con l'uso del software di elaborazione temporale liberamente disponibile è possibile avere una grande quantità di informazioni sulla qualità dell'immagine e risoluzione. Utilizzando questi parametri è allora possibile ottimizzare la procedura di imaging dall'ottica, alla preparazione del campione, scelta colorante, condizioni di buffer e impostazioni di acquisizione immagine. Abbiamo unamostrano esempi LSO di alcuni problemi comuni che si traducono in scarsa qualità delle immagini, come ad esempio la deriva laterale, dove le mosse del campione durante l'acquisizione dell'immagine e della densità legate problemi derivanti dal fenomeno 'mislocalization'.

Introduction

Recentemente una serie di tecniche di microscopia ottica sono state sviluppate, generalmente indicato come la microscopia super-risoluzione o nanoscopia, che può bypassare il limite di diffrazione e di generare immagini con una risoluzione di 100 nm o superiore ^{a 1,2.} Dal momento che l'annuncio della super-risoluzione di microscopia come il metodo Nature Methods dell'anno nel 2008, c'è stato un grande sviluppo di microscopi a base di localizzazione. Per esempio, ci sono applicazioni multi-colore ^{3-6, 7-12,} implementazioni 3D e applicazioni cellulari anche dal vivo ^5,13-17. Inoltre, poiché tali sistemi vengono commercializzati e ora stanno facendo loro uscita laboratori ottici nelle mani di biologia cellulare è probabile che un ulteriore aumento del loro uso e l'applicazione di domande biomediche.

Un ramo di questa famiglia è i metodi basati localizzazione-che lavorano costruendo una molecola per molecola immagine. Iol fine di fare ciò, la maggior parte delle molecole fluorescenti all'interno del campione deve essere spento in modo che solo poche molecole spazialmente separati sono attivi contemporaneamente. Queste molecole sono poi rapidamente accesi e spenti e molte immagini sono prese in modo che una parte significativa della popolazione è ripreso da riflettere la struttura sottostante con precisione sub-diffrazione. Un certo numero di approcci sono stati pubblicati tra cui GSDIM ^18, PALM ^19, fPALM ^20, STORM ²¹ e RESOLFT ^22. Algoritmi che misurano la posizione di una singola molecola di rilevamento possono essere usati per individuare la posizione reale della molecola con precisioni migliori di 20 nm usando Lato Gaussian ^23, ad esempio rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ^{26, 12} e palm3d temporale ^27. Quando imaging cellulare o altri campioni biologici, che hanno una densità elevata molecola, è pertanto necessario adottare diverse migliaia di fotogrammi diquesto lampeggiante, spazialmente separati, segnale per l'immagine di una parte significativa delle molecole marcate.

Stocastico la microscopia ottica ricostruzione (STORM) e altamente correlati dSTORM e metodi GSDIM sono metodi super-risoluzione in base alla localizzazione, che hanno dimostrato di lavorare con coloranti organici disponibili in commercio ^21. Da allora sono stati dimostrato di essere applicabile ad un numero di differenti coloranti ^28-30, che rende la metodologia particolarmente attraente a causa della specificità e della convenienza relativa di approcci immunomarcatura consolidate per eseguire microscopia a fluorescenza. Di conseguenza, vi è un facile accesso a una serie di coniugati anticorpo-colorante e dye-biomolecola, che hanno il potenziale di essere utilizzato in base localizzazione-super-risoluzione di immagini. Mentre i principi generali di STORM e approcci simili sono relativamente semplici, ed a prima vista la preparazione dell'hardware e del campione sembrano relativamente straightforward, ci sono una serie di passi nel processo che sono fondamentali per il raggiungimento di alta qualità, immagini super-risoluzione prive di artefatti.

Come con tutte le tecniche di microscopia il processo può essere pensato in 3 fasi principali: in primo luogo, la preparazione del campione, secondo, acquisizione immagini e, terzo, trattamento immagini e / o analisi e interpretazione delle immagini. Il potere risolutivo supplementare e il metodo di generazione di immagini super-risoluzione utilizzando un approccio basato localizzazione-introduce alcuni nuovi problemi e considerazioni ^31-33. Partendo con la preparazione del campione, durante l'esecuzione immunomarcatura, particolarmente immunofluorescenza indiretta in cui viene usata la combinazione anticorpo primario e secondario, va notato che il colorante fluorescente può essere fino a 20 nm dalla molecola di interesse. Nel caso di microtubuli, questo si traduce in diametri di 35-50 nm rispetto al diametro microtubuli atteso di 25 nm ^28,30. Inoltre, la densità di etichettatura dovrebbe meet i criteri di Nyquist per generare un'immagine di alta qualità ^14. Ad esempio per una risoluzione di immagine anticipato di 20 nm lungo una struttura filamentosa ci dovrebbe essere una molecola colorante almeno ogni 10 nm ^27. Mentre molti coloranti sono stati pubblicati a lavorare per approcci basati localizzazione, le prestazioni complessive del colorante è un mix di almeno quattro criteri fondamentali, vale a dire fotoni rivelati per la commutazione evento (la luminosità di ogni ammiccamento - luminoso è meglio), l'equilibrio su -off duty cycle (rapporto di contrasto di coloranti in off contro sullo stato - più fuori è generalmente migliore), la frazione di sopravvivenza (un tasso di sbiancamento basso è meglio) e il numero di cicli di commutazione (il numero di lampeggi per fluoroforo - altro è meglio per alta risoluzione, anche se 1 lampeggio ogni fluoroforo può essere un vantaggio per scopi di conteggio molecola). La situazione è ulteriormente complicata dal fatto che queste proprietà per qualsiasi colorante può variare in differenti condizioni di buffer econ la potenza del laser ^28,29. Inoltre, oltre a queste considerazioni STORM unici, la qualità dell'immagine può essere migliorata ottimizzando preparazione del campione nello stesso modo come le tecniche più tradizionali microscopia a fluorescenza ad esempio minimizzando autofluorescenza mediante trasformazione di metodiche di fissazione e l'uso di reagenti di raffreddamento. Inoltre, minimizzando fluorofori non specificatamente legato è importante, che può essere fatto regolando le concentrazioni di etichette, tempi di incubazione e blocco e lavaggio passaggi.

La seconda fase di acquisizione delle immagini è anche critico. Le impostazioni ottimali sul microscopio dipenderanno dalla tintura, condizioni di buffer, densità etichettatura, e tipo di campione, ad esempio monostrati su vetro, cellule o campioni di tessuto. Le considerazioni principali sono il tempo di esposizione della fotocamera, il numero di telaio, angolo di illuminazione (TIRF, Hilo, Epi) e la potenza del laser. L'obiettivo è quello di raccogliere quante più brillanti lampeggia spazialmente separati il ​​più rapidamente possibile. Se lo sfondo is molto elevate o lampeggia non sono molto luminoso, in altre parole il rapporto segnale-rumore è scarsa, l'algoritmo di ricostruzione non sarà in grado di localizzare la posizione con la massima precisione. Così come massimizzare la precisione di localizzazione, ossia la precisione con ogni posizione molecola può essere misurata, la qualità dell'immagine dipende anche da un elevato numero di localizzazioni. Se un numero insufficiente di molecole di interesse sono ripreso, sia a causa della scarsa efficienza di etichettatura, eccessiva fotoscolorimento o un numero di telaio inadeguato, allora l'immagine super-risoluzione risultante sarà puntata e discontinuo, come non sono stati rispettati i criteri di Nyquist ^14,27 .

E, infine, la terza fase, l'elaborazione delle immagini, è particolarmente importante rispetto alle tecniche di microscopia a fluorescenza. Vi è una gamma di liberamente e disponibili in commercio algoritmi, che è sia un vantaggio, in termini di scelta, e uno svantaggio, in quanto può essere fonte di confusione per sapere which è più opportuno utilizzare. Se per esempio i dati grezzi ha ben distanziati lampeggia spazialmente distinte poi un algoritmo di raccordo singola molecola può essere estremamente preciso ed efficiente, per esempio gli algoritmi di montaggio sparse disponibili in tempesta ^27, rapidSTORM ^24,25, palm3d ¹² e software QuickPALM ²⁶ . Se i dati grezzi contiene un sacco di segnali sovrapposti poi algoritmi che possono essere più opportuno includere DAOSTORM ^34, 3B ³⁵ e deconSTORM ^36. Inoltre, questi algoritmi contengono soglie per vari criteri come il numero di segnali, o fotoni per batter, nonché varie opzioni diverse di visualizzazione delle immagini come ad esempio la visualizzazione con funzioni gaussiana smussati o come istogrammi con griglie di pixel, in cui la dimensione dei pixel super-risoluzione può essere selezionato dall'utente. Tutte queste opzioni modificare l'aspetto dell'immagine finale e avere implicazioni per l'interpretazione e analisi delle immagini.

Quindi, vi presentiamo tre campioni di prova che forniranno il nuovo utente con un punto di partenza per esperimenti dye-based di localizzazione-super-risoluzione, che per motivi di chiarezza ci riferiremo come tempesta, e gli utenti più esperti la possibilità di ottimizzare ulteriormente i loro esperimenti. In primo luogo, è possibile rivestire la superficie di vetro con uno strato fluorescente di destrano coniugato con colorante. Questo fornisce un modo rapido e semplice per stabilire che il microscopio, tintura e tampone stanno lavorando per generare lampeggiante segnale fluorescente. Il metodo può essere esteso confrontando parametri medi precisione la localizzazione e numero generati da temporale per ottimizzare le condizioni di buffer, le impostazioni di acquisizione delle immagini e testare diversi coloranti. In secondo luogo, vi presentiamo un semplice protocollo per la preparazione di filamenti di actina su vetro, che può essere facilmente etichettato utilizzando coniugati phalloidin-dye. Questi forniscono strutture ideali per prendere misure di risoluzione ²⁷ e in genere la larghezza a metà massimo (FWHM)di un filamento è data una stima empirica della delibera ^37. Va notato che la risoluzione varia tra i campioni e tra le immagini all'interno dello stesso campione perché la risoluzione in super-risoluzione microscopia base a localizzazione è funzione della luminosità fluoroforo, il rumore di fondo e la densità localizzazione ²⁷ e questi non sono necessariamente costanti in tutto il campione. Filamenti di actina sono utilizzati per dimostrare i potenziali manufatti come mislocalizations e deriva e come possono essere identificati con le caratteristiche del software all'interno di temporale. Inoltre, si descrive l'utilizzo di marcatori fiduciali fluorescenti per misurare e corretta deriva. E in terzo luogo, la colorazione delle cellule con il fattore di crescita epidermico (EGF) coniugati-dye è descritto. EGF fornisce un utile indicatore di performance immagine super-risoluzione, in quanto una percentuale del recettore sulla superficie cellulare subisce endocitosi tramite vescicole, che sono strutture sub-diffrazione dimensioni di circa 50-150 nm di diametro ^27,38,39.

Protocol

Nota: Durante questo protocollo, consigli e suggerimenti sono trovati seguendo alcuni passaggi. La notazione "* 1" indica che nota 1 è rilevante per questo specifico passo, e così via.

1. Fluorescente Dextran Rivestimento di vetro

1. Aggiungere 200 ml di poli-L-lisina soluzione 0,01% a ciascun pozzetto di una coprioggetti 8-camera e incubare per 10 min. Rimuovere con una pipetta per garantire che non è liquido rimanente.
2. Ricostituire destrano-Alexa 647 ^{* 1} secondo le istruzioni del produttore per creare una soluzione madre 2 mg / ml. Da questo, diluire 0,25 ml in 25 ml di acqua deionizzata per creare una soluzione di 20 mg / ml.
3. Per creare un rivestimento ad alta densità di destrano-Alexa 647 soluzione diluita 20 microlitri della soluzione 20 mg / ml in un totale di 200 ml di acqua deionizzata. Per una soluzione a media densità diluire 2 ml in 200 ml di acqua deionizzata (1:10.000 diluizione della soluzione stock originale). Per un bassosoluzione densità diluire 0,2 ml in 200 ml di acqua deionizzata (1:100.000 diluizione dal magazzino soluzione originale).
4. Aggiungere 200 ml di diluito destrano-Alexa 647 soluzioni per ogni pozzetto e incubare per 10 min. Tempi di incubazione più lunghi possono essere usati che possono provocare un rivestimento denso destrano. Rimuovere e lavare con H ₂ O tre volte ^{* 2}

Nota 1: Altri coniugati destrano-dye possono essere utilizzati. Destrano coniugato può anche essere coniugato a coloranti se combinazioni desiderati non sono disponibili in commercio.

Nota 2: Le stesse camere di destrano possono essere reimaged per un periodo di settimane sebbene l'uniformità della fluorescenza può diminuire. Si raccomanda di conservazione a 4 ° C in assenza di buffer.

2. Fluorescente actina filamenti in vetro

1. Aggiungere 200 ml di poli-L-lisina soluzione 0,01% in ciascun pozzetto della camera e incubare per 10 min ^{* 3.} Remuoversi con una pipetta per assicurarsi che nessun liquido rimanente.
2. Aggiungere 90 ml di tampone actina generale (ricostituita secondo le istruzioni del produttore) per ciascuna camera. Aggiungere 10 ml di 10 mM preformati soluzione filamento di actina e 1 ml phalloidin-Alexa 647 (0,2 unità, una volta disciolti in 1,5 ml di metanolo come da istruzioni del produttore) e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Incubare per 30 min ^{* 4.}

Nota 3: aumentare il volume della soluzione filamento all'interno dei risultati da camera in meno vincolanti filamenti di vetro rivestita di poli-L-lisina.

Nota 4: tempi di incubazione fino a 48 ore a 4 ° C sono stati testati con buoni risultati. Qualità dell'immagine si deteriora actina filamento volta una camera è stata esposta al buffer di commutazione in modo che non è consigliabile utilizzare lo stesso campione per più di un giorno.

3. Microsfere perline fluorescenti come Fiducial Marker

1. Diluire 1 ml di TetraSpeck perline in 200 microlitri di PBS e mescolare.
2. Aggiungere le perline diluiti in una camera di imaging e attendere 15 min ^{* 5.} Rimuovere la soluzione e lavare 3 volte con PBS prima di imaging.

Nota 5 - il tempo di diluizione e di incubazione può essere aggiustata per ottenere diverse densità di perline. Questo protocollo si traduce tipicamente tra 3-10 perle per 20,5 micron x 20,5 micron campo di vista.

4. Epidermal Growth Factor colorazione cellulare

1. Cellule HeLa in coltura camere di imaging a circa il 80% di confluenza in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e soluzione di penicillina-streptomicina 1%.
2. Rimuovere il terreno di coltura e lavare con PBS. Poi aggiungere 500 ml di soluzione di formaldeide al 4% (4 ml soluzione di formaldeide al 10%, 1 ml di PBS 10X, 5 ml di acqua) per 10 min. Rimuovere la formaldeide e lavare 3 volte con PBS. Non permettere alle cellule di rimanere dry e utilizzare sempre PBS tamponata soluzioni per evitare lo stress ipotonico.

ATTENZIONE - formaldeide è estremamente tossico. Assicurarsi che i guanti adeguati, occhiali di protezione e camici vengono indossati. Controllare le linee guida locali per lo smaltimento di formaldeide.

3. Ricostituire EGF-Alexa 647 secondo le istruzioni del produttore per creare una soluzione stock 50 mg / ml. Aggiungere 2 ml di questa soluzione a 200 ml di soluzione di BSA allo 0,1% (in PBS). Rimuovere la PBS dalle cellule, aggiungere la soluzione EGF e incubare per 30 min.
4. Rimuovere la soluzione e lavare 3 volte con PBS prima di aggiungere una soluzione di bloccaggio di 0,1% di BSA (in PBS) per 15 min. Rimuovi questo e lavare altre 3 volte con PBS prima di imaging.

5. Commutazione Buffer Preparazione

1. Effettuare una soluzione di riserva enzima (A) con 10 ml di catalasi (20 mg / ml), 20 ml di 1 M Tris (2-carboxyelthyl) fosfina cloridrato (4 mm), 2,5 ml di glicerina (50%), 125 mldi 1 M KCl (25 mM), 100 ml di 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg di glucosio ossidasi (1 mg / ml) e superiore fino a 5 ml di volume con diH20. Questo è sufficiente per rendere 100 x aliquote di 50 microlitri, che possono essere conservati a -20 ° C ed utilizzate per massimo 1 anno.
2. ) Fare una soluzione di riserva di glucosio (B) con 4 g di glucosio (100 mg / ml), 4 ml di glicerina (10%) e 36 ml diH20. Questo è sufficiente per rendere 100 x 400 microlitri aliquote, che possono essere conservati a - 20 ° C ed utilizzate per massimo 1 anno.
3. Fare un agente riducente soluzione madre (C) con 113,6 mg di MEA-HCl (1M) e 1 ml di diH ₂ a 0. Utilizzare fresco o fare 10 x 100 microlitri aliquote, che possono essere conservati a -20 ° C ed utilizzate per fino a 1 mese (non ricongelare aliquote).
4. Poco prima di imaging, mescolare l'enzima (A), glucosio (B) e agente riducente (C) soluzioni madre insieme nel rapporto di 50 microlitri, 400 ml, 100 ml e portare a 1 ml con PBS ^{* 6.} Questo tampone ora scavenging ossigeno e hanno un ambiente riducente (MEA-100 mMHCl) ^{* 7.} Il pH finale dovrebbe essere nel range 6,0-8,5 (regolazione non è normalmente necessario) ^{* 8.}

Nota 6 - questo tampone è adatto per l'uso con coloranti a base carbocyanine-come Cy5 e Alexa 647.

Nota 7 - le concentrazioni enzimatiche finali sono 50 pg / ml (5 unità / ml) di glucosio ossidasi e 1 mg / ml (40-60 unità / ml) di catalasi. L'attività enzimatica (unità) è data da fornitori e può variare. I calcoli per la catalasi presuppongono che 1 mg / ml concentrazione finale dopo il punto 5.4 conterrà 50 unità di enzima. Varie composizioni del buffer compresi analoghe componenti che assorbono l'ossigeno può essere trovato ^21,30,40. Per un riepilogo delle combinazioni tampone e tintura vedi riferimenti ^28,29. Glicerina e TCEP sono necessari per la conservazione a lungo termine a -20 ° C.

Nota 8 - se filamenti di actina immagini aggiungono 2 mM MgCl ₂ e 0,2 mM ATP per contribuire a stabilizzare tha filamenti.

6. Microscopio Acquisizione di STORM dati (con Alexa 647 colorante)

1. Accendere il microscopio STORM / PALM, preferibilmente almeno 3 ore prima di imaging per consentire un equilibrio termico da raggiungere. Imaging prima di questo ha una maggiore probabilità di deriva.
2. Inserire la camera di imaging nel supporto del campione palco microscopio. Assicurarsi che il campione sia saldamente nel supporto ed è piatta.
3. Rimuovere la PBS dalla camera di imaging e poi riempire verso l'alto con il buffer di commutazione. Posizionare con cura il vetrino sopra la parte superiore della camera, facendo attenzione che non ci siano bolle a tutti e che l'intera camera è coperto. Top con buffer aggiuntivo o PBS se eventuali bolle sono visti diversamente tampone prestazioni possono diminuire.

ATTENZIONE - per minimizzare le possibilità di deriva laterale e assiale del campione in relazione alla lente obiettivo si raccomanda che il campione e il buffer sono lasciati equilibrarea temperatura ambiente per almeno 15 minuti prima di imaging.

4. Individuare una fluorescente struttura di interesse per essere ripreso. Selezionare l'angolo desiderato di illuminazione, in questo caso, un angolo TIRF o fortemente inclinate è raccomandata in quanto migliora il rapporto segnale-rumore minimizzando luce fuori fuoco, particolarmente di beneficio per campioni di cellule. Prendere una immagine a diffrazione limitata di riferimento della struttura prima di imaging tempesta.
5. Aumentare il laser di eccitazione (con una lunghezza d'onda di eccitazione appropriata di circa 640 nm) ad una elevata potenza, pari a circa 2 kW / cm ^2, mentre l'imaging con impostazioni della fotocamera di esposizione 10 msec e un tempo di ciclo di circa 50 Hz (fotogrammi al secondo) . Una volta che i fluorofori hanno transitato in un modello lampeggiante sparso (probabilmente meno di 10 secondi per la maggior parte dei campioni) raccogliere 10.000 fotogrammi ^{* 9.}

Nota 9 - 10.000 fotogrammi è adatto per i campioni qui descrittima può essere necessario aumentare il numero di frame di 50.000 o più per gli altri campioni.

7. Ricostruire Super-Resolution immagini dai dati grezzi (utilizzando temporale)

1. Aprire il file rainSTORM.m dall'interno di MATLAB ed eseguire (Figura 1A).
2. Nella finestra temporale (Figura 1B), selezionare il file immagine da analizzare utilizzando il pulsante Sfoglia. Questo dovrebbe essere un file. TIF (ImageJ può essere utilizzato per convertire altri tipi di file in un formato TIF). Modificare la larghezza in pixel per abbinare i dati grezzi del sistema microscopio utilizzato per acquisire i dati ^{* 10.} Lasciare gli altri valori di default.

Nota 10 - Un tipico EMCCD fotocamera ha una dimensione di pixel di 16 micron così su un sistema con una lente obiettivo 100X la dimensione pixel dell'immagine sarà 160 nm. Nei sistemi commerciali la dimensione dei pixel è solitamente visualizzato all'interno del software. Dimensioni dei pixel variano tra 100 nm e 160 nm per la maggior parte dei microscopi di localizzazione.

3. Premere il pulsante 'Process Images "e attendere che appaia un'immagine preliminare. La durata del trattamento dipenderà dalla dimensione del file, specifica computer e il numero di lampeggi candidati all'interno dei dati grezzi ^{* 11.}

Nota 11 - 10000 sequenze di fotogrammi di actina e dati FEG ha preso 23 sec e 25 sec per elaborare rispettivamente utilizzando un PC con una CPU Intel Xeon E5420. Utilizzando lo stesso computer senza uno strumentario elaborazione parallela in MATLAB, o con un computer senza core aerei, tempi erano 66 sec e 81 sec rispettivamente.

4. Per generare un'immagine super-risoluzione premere aggiornato il tasto 'Open Revisore' e apparirà una seconda finestra (Figura 1C). Premere il pulsante 'Regolare il contrasto', al fine di modificare la visualizzazione dell'immagine, se lo desideri (Figura 1D). In alcuni casi, dove l'immagine è molto scura il valore massimo deve essere ridotta.
5. Utilizzare il revdel visualizzatore finestra (Figura 1C) per generare le metriche utili qualità delle immagini e perfezionare ulteriormente l'immagine di super-risoluzione. Impostare i primi tre parametri di controllo di qualità a valori di 4.000, 0,1 e 0,8-2,0 rispettivamente ^{* 12.} Aggiornare i conteggi per un valore di fotoni, che dovrebbe essere sia basata su una misurazione di calibrazione fotone o l'utilizzo fotone-curva valori della curva di calibrazione specificati dal produttore della fotocamera per una particolare impostazione di guadagno EM. Questo è fondamentale per ottenere precisione accurata e misure di risoluzione ^{* 13.}

Nota 12 - Conti segnale respinge lampeggia in base a criteri di luminosità. Più alto è il valore più luminosa batter deve essere quello accettato come localizzazione nell'immagine finale. Ciò può essere modificata a seconda dell'uscita fotone del tempo colorante e l'esposizione e la sensibilità della telecamera. Tolleranza rifiuta lampeggia se vi è un significativo errore quadratico tra il segnale e il attrezzata gaussiana cioè dpicchi ouble. PSF Sigma Gamma rifiuta lampeggia se la larghezza attrezzata del PSF si trova fuori di questo intervallo, cioè una gamma più ristretta può essere usata per respingere out-of-focus segnali e grandi macchie aggregate di costante fluorescenza. Utilizzando una gamma più ampia può causare artefatti mislocalization appaiono nell'immagine finale. In pratica, si consiglia di eseguire il controllo iniziale della qualità utilizzando il parametro cutoff precisione di localizzazione.

Nota 13 - per maggiori informazioni su metriche di risoluzione vedi riferimenti ^23,27. In breve conoscendo il numero di fotoni prodotti da ogni ammiccamento è possibile calcolare la precisione di localizzazione di ciascuna localizzazione e di conseguenza il grado di DERIVE significare stime di precisione per l'intera immagine. Utilizzando un Andor Ixon DU-897E con un'impostazione di guadagno di 200 Conti per valore Photon è 9.04.

6. Modificare il taglio di precisione di localizzazione (Figura 1C) per ottimizzare il compromesso tra precis localizzazione mediion contro il numero localizzazione nell'immagine finale. Valori di 30-50 nm sono raccomandati in funzione della qualità dei dati e il campione. Entrambi gli istogrammi ei file info.txt possono essere utilizzati per informare questa decisione (figure 1F e 1G).
7. Il fattore di scala ricostruzione (Figura 1C) di default è 5, che genererà super-risoluzione pixel di 32 nm, assumendo che la larghezza in pixel nelle immagini originali è di 160 nm. Se le immagini crude hanno una dimensione in pixel di 100 nm questo produrrà immagini super-risoluzione con pixel di 20 nm. Aumentare il fattore di scala per la produzione di piccoli super-risoluzione pixel nell'immagine finale ^{* 14.}

Nota 14 - Risoluzione della microscopia localizzazione dipende dalla lisciatura desiderata per la visualizzazione (cioè la dimensione del pixel di una semplice ricostruzione istogramma) e la precisione di localizzazione. In pratica, la dimensione dei pixel ricostruzione dovrebbe generalmente essere inferiore alla localizzazioneprecisione (vedere la metrica media precisione Stima nel file di testo informativo - i punti 6.11 e 6.12). In questo caso la perdita di risoluzione a causa di ricostruzione dimensioni dei pixel sarà piccolo ^23,27. Ad esempio, le stime medie di precisione nella fila e la direzione della colonna di figura 4E sono 16.1 nm e 16.2 nm. Dimensioni pixel di 16 nm è stato usato per visualizzare dati (fattore di scala ricostruzione di 10 con una larghezza di pixel originale 160 nm).

8. Modificare l'intervallo di fotogrammi limite (Figura 1C) per limitare la ricostruzione di sottoinsiemi di dati grezzi, per esempio [2001-inf] escluderebbe i primi 2.000 frame di dati grezzi.
9. Premere il pulsante 'Run Revisore' (Figura 1C) per generare un'immagine super-risoluzione aggiornato (Figura 1E).
10. Premere il pulsante 'Mostra istogrammi "(Figura 1C), al fine di visualizzare i parametri di qualità dell'immagine (Figura 1F) ^{* 15.}

Nota 15 - Il grafico in alto a destra raffigurante il numero di localizzazioni accettate contro numero di telaio telecamera e l'istogramma Thompson localizzazione Precisazioni in basso a destra (Figura 1F) può essere utilizzato per informare l'opzione di revisione taglio di precisione di localizzazione. Ad esempio, utilizzando un cutoff 50 nm escluderebbe tutte le localizzazioni con precisione peggio venga incluso l'immagine finale super-risoluzione.

11. Premere il pulsante 'Salva immagine' nella recensione (Figura 1C) per salvare tutti questi dati ^{* 16.}

Nota 16 - Tra 3 e 5 file possono essere salvati in base alle opzioni selezionate (immagine somma, STORMdataImage, STORMprocessed, informazioni e hists), vedi Figura 1G. L'immagine elaborata STORM viene visualizzata con le mappe contrasto e colori modificati. Il STORMdataImage è un'immagine in scala di grigi, in cui il livello di grigio di ogni pixel è uguale insensibileer di localizzazioni che sono stati individuati all'interno di esso.

12. Dopo aver esaminato i dati (ad esempio Info.txt di file e istogrammi), il ritorno al punto 7.6 e ripetere i passi successivi con diversi parametri membro, se lo desideri. Premendo 'Salva immagine' al passo 7.11 sovrascrive i dati precedentemente salvati.

8. Box di monitoraggio e correzione Drift (utilizzando temporale)

1. Seguire i passaggi 7,1-7,9 per generare un'immagine in modo normale.
2. Premere il pulsante 'Box inseguimento' nella recensione (Figura 1C) e fare clic e trascinare una casella su marcatore fiduciale o struttura di interesse sull'immagine recensito.
3. Attendere fino a quando appare una nuova immagine, che visualizzerà le "posizioni Boxed" (vedi figure 6B, 6C e 6F per gli esempi). Salva l'immagine, se lo desideri.
4. Se l'oggetto di interesse è un marker fiduciali poi deriva la correzione può essere effettuata cliccando sul pulsante 'Set Anchor' seguito dal 'SubPulsante tratto Drift '. Infine, fare nuovamente clic su 'Esegui Revisore' per generare una nuova immagine STORM, che adesso avrà tutte le localizzazioni corrette secondo le posizioni dei marker fiduciali. Le posizioni tallone vengono eliminati dall'immagine finale recensito.
5. Se ci sono altri markers fiduciali all'interno dell'immagine finale deriva corretta, questi possono essere rimossi premendo 'Box inseguimento', 'Elimina Boxed' e poi tante volte «Run utente 'come desiderato.

Results

Dextran

Un rivestimento successo di destrano dovrebbe produrre un monostrato fluorescente. Presso l'alta concentrazione dovrebbe apparire relativamente uniforme. A concentrazioni più basse apparirà più rada (Figura 2A). Molti microscopi STORM / PALM hanno la capacità di cambiare l'angolo di illuminazione da epifluorescenza a TIRF. Quando si utilizza un pieno telecamera telaio, per esempio a 512 x 512 pixel su una tipica fotocamera EMCCD, un'illuminazione uniforme deve osservare. Se ci sono delle strisce o regioni out-of-focus questo può indicare che il campione deve essere reinserito nel portacampione con olio nuovo sulla lente obiettivo. In alternativa si può indicare un problema con il microscopio.

Quando l'acquisizione di dati grezzi super-risoluzione il laser di imaging dovrebbe essere aumentato al potere per circa 2 kW / cm ^2. Ci sarà una raffica iniziale di fluorescenza seguita da lampeggiare i fluorofori sono guidati inagli stati scuri temporanei. Ad alta densità destrano lampeggia rischiano di sovrapporsi, soprattutto in prossimità dell'inizio della acquisizione dell'immagine (Video 1). A densità media e bassa lampeggia questi dovrebbero essere sparso, cioè spazialmente separati, e nel fuoco senza sfondo evidente (vedi telai 2.000, 5.000 e 8.000, Figura 2A, Video 2 e 3). Durante questa fase di acquisizione dell'immagine, a laser illuminazione costante, il numero di lampeggi diminuisce con il tempo (confrontare con telaio telaio 2.000 8.000 nel campione ad alta densità, Figura 2A). La differenza principale tra le varie immagini super-risoluzione delle diverse concentrazioni di destrano (alta, media e bassa) è la diminuzione del numero di localizzazioni (Figure 2A e 2B). In altre parole, la concentrazione delle molecole fluorescenti, numero di lampeggi dei dati grezzi e il numero di localizzazioni hanno una relazione proporzionale. Questa relazione,tuttavia, non è semplice lineare ad altissima densità di molecola il software è in grado di localizzare con successo molecole (confrontare le linee rosse e blu, Figura 2C). La ragione di questo è che alla concentrazione elevata non è possibile per il software di elaborazione per adattarsi alle posizioni usando l'algoritmo raccordo gaussiana dove i lampeggi sono non-sparse. Come lampeggia diminuiscono attraverso la fase di acquisizione a causa photobleaching il software può adattarsi sempre di più lampeggia quando diventano radi (Figure 2A e 2C). Inoltre, molecole di colorante individuali possono lampeggiare, e quindi essere localizzato più di una volta ^28,41,42.

Un problema comune quando l'imaging uno di questi campioni, ma soprattutto l'alta densità quello destrano, può essere la presenza di foschia fluorescenza brillante ma sfocata che sembra essere rapidamente diffondendo durante la tempesta dell'immagine fase di acquisizione. Questo è distinto dai fluorofori ad alto contrasto sula superficie del vetro, che può essere visto lampeggiante (Figura 3A, Video 5). Queste molecole fluorescenti distaccati possono essere prevenute o rimossi aumentando il numero di fasi di lavaggio con PBS prima di aggiungere il buffer di commutazione o con l'aggiunta di tampone fresco commutazione alla camera (Figura 3B, Video 6). Elaborare e confrontare i dati di ogni risultati in sequenze di immagini molto diverse immagini super-risoluzione che hanno una diminuzione sia del numero di localizzazioni e la precisione con cui possono essere dotati del software per localizzare i lampeggi (figure 3C, 3D, 3E e 3F).

Filamenti di actina

Filamenti di actina preformati possono essere visti attaccato alla superficie del vetro da diffrazione limitata per immagini (Figura 4A-4C). Se il numero di filamenti appare molto basso, poi un tempo di incubazione più lungo può essere usata o una diminuzione del volume della actinasoluzione filamento aiuta anche. Selezione di singoli filamenti relativamente luminosi (Figura 4D) piuttosto che aree aggrovigliati traduce in una migliore qualità delle immagini. Durante la fase di acquisizione, luminosi in-fuoco lampeggia dovrebbero essere viste lungo la lunghezza del filamento (Video 7). Sparse lampeggiante deve essere visto durante la fase di acquisizione e successivamente nei dati elaborati ci dovrebbe essere un filamento continuo sottile (Figura 4E) e le localizzazioni per frame dovrebbero un graduale declino (Figura 4F), a differenza di Figura 3E.

Se lampeggiante è non-sparse, o se il software non essere in grado di localizzare le molecole, un manufatto più sottile, chiamato mislocalization ^32, può risultare. Ciò si verifica quando le medie software la posizione di due molecole si sovrappongono e la localizzazione è in posizione intermedia tra loro. Un'indicazione che non ci sono stati un numero significativo di sovrapposizione bliNKS, e di conseguenza mislocalizations, è che le stime di precisione medie dovrebbero essere le stesse in riga e di colonna direzioni, ossia orizzontalmente e verticalmente, dove ci sono mislocalizations questi sarebbero verificati lungo la lunghezza del filamento, hanno prodotto una più grande lampeggio normale ( cioè sviluppa su più pixel), che sarebbero quindi stati localizzati con meno precisione in una delle direzioni. Ciò è più facilmente visibile dove c'è un singolo filamento di actina nella area di esposizione ed è disteso orizzontalmente o verticalmente. In questo caso, il microscopio STORM, ha raggiunto una precisione media di 16 nm in entrambe le direzioni. Ciò si traduce in un limite di precisione, una misura della risoluzione dell'immagine effettiva di circa 34 nm. Questi parametri sono forniti da temporale ^27, tuttavia, come abbiamo una struttura filamentosa di diametro uniforme, 7 nm con la piccolissima phalloidin-Alexa 647 etichetta possiamo prendere una misura di FWHM per stimare la risoluzione dell'immagine. Per draala una linea retta attraverso il filamento delle immagini super-risoluzione in ImageJ (Figura 4G), utilizzando la funzionalità di profilo grafico (Figura 4H) e successivamente eseguire un fit gaussiano (figura 4I) la FWHM è calcolato come 43,2 nm. Quando si tenta questa misura è consigliabile che la dimensione dei pixel deve essere uguale o leggermente inferiore alla stima media di precisione per l'immagine (vedi file info.txt figura 1G). In questo caso, 16 pixel nm sono stati usati per ricostruire un'immagine.

Due problemi correlati possono verificarsi con la tempesta, dove i fluorofori lampeggianti diventano non-sparse, ossia singole molecole a circa 250 nm batter allo stesso tempo e quindi i segnali si sovrappongono. Il primo è che a seconda dell'algoritmo e criteri di controllo della qualità che utilizza, i battiti potrebbero non essere localizzati affatto. Ciò si traduce in immagini super-risoluzione con poche o nessuna localizzazioni. Il secondo problema dimislocalizations si verifica quando i due lampeggi sono verificati sufficientemente vicini gli uni agli altri per apparire come un unico battito. In questo caso la posizione nell'immagine finale rappresenta una media dei due. Per maggiori dettagli su questo vedi riferimento ^32. In entrambi i casi questo può verificarsi con campioni molto alta densità di potenza laser insufficiente o con commutazione problemi del buffer. Questo problema è evidente dove un numero di filamenti di actina sono ramificazione e / o incrociandosi (Figure 5A-D, Video 9). Elaborando sottoinsiemi di cornici, e confrontando i primi e gli ultimi 5.000 fotogrammi possiamo vedere una immagine risultante diversa. Nell'immagine super-risoluzione utilizzando i primi 5.000 fotogrammi (Figura 5C) possiamo vedere che ci sono molte localizzazioni nel centro dell'immagine, ma quando si utilizzano gli ultimi 5.000 fotogrammi, ben pochi di questi sono evidenti e ci ritroviamo con solo i filamenti, anche se un po 'discontinuo dovuto al basso numero di localizzazioni in image (Figura 5D). Se una troppo alta densità lampeggio è sospettato confronto delle immagini con la localizzazione per dati di frame può suggeriscono fortemente che questo problema si verifica, durante la prima serie di fotogrammi c'è un numero medio di localizzazioni per frame di oltre 10 rispetto all'ultimo set di fotogrammi in cui è di circa 4 (figura 5E). Per ridurre al minimo la probabilità di mislocalizations verificando è ideale per avere il minor numero localizzazioni per frame possibile, anche se ci sono un gran numero di molecole di essere ripreso, cioè per un campione ad alta densità, ciò richiede che un gran numero di acquisizione cornici prese porta a un altro problema in microscopia STORM che è deriva.

Laterale Drift - filamenti di actina e Fiducial Marker

Drift verifica quando i movimenti di esempio in relazione alla lente obiettivo attraverso la fase di acquisizione dati. Questo è difficile o impossibile da vedere During fase di acquisizione dell'immagine, soprattutto se è laterale anziché assiale, o se non sia specificamente misurato, come è tipicamente inferiore a 50 nm nel corso di diversi minuti per sistemi microscopio relativamente stabili. Tuttavia, in immagini ricostruite di strutture note come filamenti di actina con struttura ben definita, può essere rilevato nelle immagini super-risoluzione. Il primo segno che deriva laterale può essersi verificato è che la struttura è più grande del previsto (Figura 6A, Video 8) per esempio con una relativamente grande FWHM confrontati con i dati limite di precisione temporale, in questo caso 90 nm rispetto a 67 nm. Tuttavia, un modo migliore per rilevare la deriva è confrontando le localizzazioni in funzione del tempo, cioè vedere se le localizzazioni nei frame successivi sono spostate rispetto a quelle in primi telai. Questo può essere chiaramente visto nel caso di filamenti di actina, che sono molto piccole e di struttura uniforme, quandovisualizzati con un codice di colore utilizzando la funzione di monitoraggio box in tempesta (Figure 6B e 6C).

Drift è un problema ben noto e ci sono una serie di strategie che possono essere utilizzati per ridurre al minimo ¹⁹ o correggerla post-acquisizione sia utilizzando marcatori fiduciali ^21,43 o cross-correlazioni ^44. Per misurare deriva e corretta per esso, perline fluorescenti di 100 nm di diametro possono essere utilizzate come marcatori fiduciali (Figura 6D). Perché sono piccola e luminosa la loro posizione può essere misurare con precisione utilizzando algoritmi di fitting gaussiana, come temporale. In un esempio in cui c'è relativamente grave deriva di circa 100 nm nel corso di 3 min 10 sec, durante la fase di acquisizione (Figura 6E), la funzione di monitoraggio stessa scatola può essere utilizzata per codice colore e confermare verificato che deriva (Figura 6F ). Come tutte le quattro perle di questo esempio mostrano deriva quasi identico è possible per selezionare uno di loro, in questo caso cordone 2, da utilizzare come riferimento e sottrarre la deriva dalle altre perline (Figura 6G). Aggiungendo marker fiduciali ad un campione biologico di interesse diventa quindi possibile misurare e correggere qualsiasi deriva in cui la struttura sottostante è sconosciuto o molto più variabile di un filamento di actina o una perlina fluorescente.

Epidermal Growth Factor

Infine, le cellule HeLa EGF-colorati possono essere usati per dare un esempio realistico di risoluzione dell'immagine in cellule (Figura 7A, Video 10). Queste cellule sono relativamente semplice immagine come dovrebbero avere la maggioranza della EGF-fluorescenza nel fuoco aereo-di-sulla superficie cellulare in prossimità coprioggetti. La regione meno luminosa della a centro corrisponde alla posizione del nucleo. TIRF illuminazione può migliorare la qualità dell'immagine eliminando fluorescenza out-of-focus proveniente da parti della cellula membrane non in prossimità del vetro (circa 150 nm penetrazione nelle cellule). ingrandita in regioni di interesse nell'immagine diffrazione limitata sono in genere indistinto (Figure 7B e 7C), tuttavia nelle immagini super-risoluzione ci dovrebbe essere una miscela di cluster e occasionali isolati singoli pixel (figure 7D-7F). Questi rappresenteranno sia recettori di EGF isolati sulla superficie cellulare o possibile una piccola quantità di legame non specifico. I cluster saranno circa 100 nm di diametro e sono suscettibili di corrispondere ai box e vescicole formano, il percorso attraverso il quale EGF è prevalentemente down-regolato e endocitato. Tipici stime medie precisione sono circa 20 nm per questo tipo di campione con un limite di precisione di circa 45 nm. Va notato che questa misura limite precisione di risoluzione effettiva non prende in considerazione la dimensione dell'etichetta, o qualsiasi deriva, che può essere misurata con marcatori fiduciali, ma è ancora noticeable da "code di cometa" sui cluster o utilizzando la funzione di monitoraggio scatola come indicato in figura 6 e descritto nel capitolo 8 del protocollo.

Componente	Concentrazione finale
Catalasi	1 mg / ml (50 unità)
Glucosio	40 mg / ml
Glucosio ossidasi	50 mg / ml
Glicerina	12,50%
KCl	Da 1,25 mm
MEA-HCl	100 mM
TCEP	200 micron
Tris	1 mM

Tabella 3. Buffer di commutazione

Impostazioni di acquisizione tipici	Valore
Dimensione dei pixel (nm)
Tempo di esposizione (msec)	10
Guadagno	200
Dimensione del fotogramma (pixel)	128 x 128
Tempo di ciclo (fps)	52.5
Numero di telaio	10.000
640 nm laser densità di potenza (kW / cm 2)	2

160

Tabella 4. Impostazioni di acquisizione

Figura 1. STORM ricostruzione dell'immagine utilizzando temporale. (A) Apertura temporale dall'interno di MATLAB. (B) temporale interfaccia utente grafica (GUI). (C) temporale Revisore GUI. (D) Regolare finestra contrasto. (E) immagine STORM dopo la revisione e regolazione del contrasto. (F) Il suopittogrammi di metriche di qualità dell'immagine. (G) File generato dopo aver premuto il pulsante Salva immagine viaggiatore GUI. Clicca qui per ingrandire la figura .

(DL) Figura 2. (A) Diffrazione limitata immagini mostrano concentrazioni diverse di destrano prima di imaging STORM. Super-risoluzione (SR) ricostruzioni di immagini hanno una dimensione di pixel di 25 nm. 10.000 immagini sono state raccolte con un pixel formato 128 x 128 telaio e singoli fotogrammi sono mostrati da quella sequenza (2.000, 5.000, 8.000). Acquistato con un tempo di 10 msec di esposizione a 52.5 fotogrammi al secondo. Le immagini hanno una dimensione di pixel di 160 nm. Per chiarezza di visualizzazione di un pixel saturazione aumento del contrasto dello 0,1% è stata applicata utilizzando ImageJ. La precisione mediostime sono 28 nm (alto), 24 nanometri (medium) e 16 nm (basso) per le diverse immagini destrano. Le densità di localizzazione sono 724 per micron ² (alto), 526 per micron ² (medio) e 13 per um ² (basso). (B) Il grafico mostra una media di tre sequenze 10.000 fotogrammi di ciascuna concentrazione di destrano. Le barre di errore indicano la deviazione standard. (C) Grafico riportando il numero di localizzazioni accettati per frame utilizzando un rotolamento 100 media telaio. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Scarsa qualità dei dati Dextran. (A) Diffrazione cornice limitata da una sequenza di 15.000 telaio STORM. Si noti la foschia diffusa fluorescente attraverso l'immagine. Questo è causato da fluoropho res diffusione attraverso il mezzo. 128 x 128 pixel di dimensioni fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. (B) Lo stesso che (A) dopo il buffer era stata modificata. Notare il contrasto migliorato fluorofori non legate sono state spazzate via. (C) Una immagine super-risoluzione ricostruzione corrispondente ai dati raccolti in (A). Identiche dimensioni dell'immagine, ma con pixel di 25 nm. La stima di precisione media è di 35 nm. (D) Una immagine super-risoluzione ricostruzione corrispondente ai dati raccolti in (B). Identiche dimensioni dell'immagine, ma con pixel di 25 nm. La stima di precisione media è di 30 nm. (E) Grafico riportando il numero di localizzazioni accettati per fotogramma, utilizzando un rotolamento 100 media struttura. La linea rossa corrisponde alla sequenza STORM (A & C), dove c'è un fondo elevato. La linea blu mostra i dati corrispondenti a (B & D), in cui lo sfondo è basso. (F) Il grafico mostra il numero di localizzazione accettato per le immagini corrispondenti al più alto (C) e (D) i dati di fondo bassi.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Clicca qui per ingrandire la figura.

Figura 4. Dati Actina tipica. (AC) immagini diffrazione limitata di filamenti di actina prima aggiunta di tampone e di imaging STORM commutazione. Lunghezze variabili di filamenti può essere visto. Molto filamenti brillanti sono spesso diversi filamenti aggrovigliati insieme. Dimensione dei pixel è di 160 nm. (D) Una immagine a diffrazione limitata di un singolo filamento di actina. (E) immagine STORM (0,1% contrast enhancement applicata in ImageJ). Da una sequenza 10.000 telaio con una dimensione di 128 x 128 pixel telaio, un tempo di esposizione 10 msec e acquisita a 52,5 fotogrammi al secondo. La dimensione dei pixel è di 16 nm. La stima di precisione media è di 16 nm. (F) Grafico riportando il numero di localizzazione accettates per fotogramma, utilizzando un rotolamento 100 media struttura. (G) A ingrandita regione del filamento di actina da (E) prima di contrasto valorizzazione con un profilo di linea gialla tracciata attraverso. (H) Una vista di profilo grafico dalla linea gialla tracciata attraverso il filamento di actina. Generato in ImageJ. (I) Una forma gaussiana del profilo di stampa utilizzando l'utensile di montaggio curva in ImageJ. La deviazione standard, d, è stato moltiplicato per 2,35 per ottenere una misura FWHM di 43,2 nm. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. Mislocalized Actina filamenti. (A) diffrazione limitata actina filamento. 160 pixel nm. (B) immagine STORM di filamenti di actina in (A). Da una sequenza di 20.000 frame con un pixel fram 128 x 128e dimensioni, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. La dimensione STORM pixel è 16 nm. Tutti i 20.000 fotogrammi sono stati elaborati. La stima di precisione media è di 17 nm. (C) come (B) ma con solo i primi 5000 fotogrammi della sequenza 20.000 telaio processati. La stima precisione medio è di 18 nm. (D) come (B), ma con solo gli ultimi 5.000 fotogrammi della sequenza 20.000 telaio processati. La stima di precisione media è di 17 nm. (E) Grafico delle localizzazioni per dati di frame da pieno 128 x 128 frame vista pixel.

Figura 6. (A) immagine STORM di un filamento di actina ricostruito da una sequenza di 10.000 frame con una dimensione di 64 x 64 cornice pixel, un tempo di esposizione msec 10 e portato a 64,6 fotogrammi al secondo laterale Drift.. La dimensione STORM pixel è 32 nm. La stima di precisione media è32 nm. (B) Una immagine STORM visualizzata utilizzando la funzione 'Box di monitoraggio' in temporale. Localizzazioni sono visualizzati con un colore corrispondente al numero di telaio di quando sono stati acquistati, per esempio, le localizzazioni dalle prime ore del sequenza di acquisizione sono blu; localizzazioni dalla fine della sequenza di acquisizione sono rossi. I colori sfollati indicano che si è verificato deriva. (C) Un zoom in regione (A) visualizzata utilizzando la funzione Box inseguimento in tempesta. I colori sfollati indicano che si è verificato deriva. (D) Una immagine di diffrazione limitata di quattro perline fluorescenti 100 nm, che può essere utilizzata come marker fiduciali. Dimensione dei pixel 160 nm. Numeri 1-4 spettacolo ritagliato e ingrandito perline singolarmente. (E), ogni pietra fluorescente corrispondente a (D) ricostruita in tempesta da una sequenza di 10.000 frame con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. La dimensione STORM pixel è 5 nm. La stima di precisione media è 7 nm. (F) Perle corrispondenti a (D) e (E),visualizzati utilizzando la funzione 'Box inseguimento'. I colori sfollati indicano che si è verificato deriva. (G) Uso del numero di cordone 2 come riferimento, perline 1, 3 e 4 sono visualizzati dopo la funzione 'Sottrai Drift' è usato in tempesta. Confronto con (E) mostra che lo spostamento laterale è stato corretto. La dimensione STORM pixel è 5 nm. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 7. Dati EGF tipico. (A) Diffrazione immagine limitato di parte di una cellula HeLa focalizzato sulla superficie delle cellule basali. Scatole gialle indicano zoom in regioni di interesse mostrati in (B) e (C). (B) ingrandita immagine di diffrazione limitata dalla regione vicino al bordo della cella (casella B) in. (C) ingrandita di diffrazione limitata immagine da regione sotto il nucleo (casella C). (D) l'immagine STORM corrispondente a (A). Da una sequenza 10.000 telaio con una dimensione di 128 x 128 pixel telaio, un tempo di esposizione 10 msec e acquisita a 52,5 fotogrammi al secondo. La dimensione STORM pixel è di 25 nm. La stima di precisione media è di 21 nm. (E) immagine STORM corrispondente alla casella di posta (D). (F) immagine STORM corrispondente alla casella F (D). (G) Localizzazioni per dati di frame da (D). Clicca qui per ingrandire la figura .

Video. 1-4 Video corrispondono alla figura 2A con concentrazioni variabili di destrano: 1 = alta, 2 = medio, 3 = basso, 4 = nessuno). 10.000 sequenze di fotogrammi con 128 x 128 pixel, dimensioni dei frame acquisiti con un tempo di esposizione 10 msec a 52,5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> video 2, Video 3 , Video 4

Video 5-6. Video corrispondono alla figura 3 A e B. Video 5 è pre-lavaggio e Video 6 è post-lavaggio dopo fluorofori non legati sono stati rimossi. 15.000 sequenze di fotogrammi con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 5 , video 6 .

Video 7. Video che mostra la sequenza di telaio grezzo che è stato elaborato per generare l'immagine STORM in figura 4E. 10.000 telaio sequence con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 7 .

Video 8. Video che mostra la sequenza di telaio grezzo che è stato elaborato per generare l'immagine STORM in figura 5B. 20.000 sequenza di frame con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 8 .

Video 9. Video che mostra la sequenza di telaio grezzo che è stato elaborato per generare l'immagine STORM in figura 6A. 10.000 sequenza di frame con una dimensione di 64 x 64 cornice pixel, un tempo di esposizione msec 10 e portato a 64,6 fotogrammi al secondo. Click qui per vedere il video 9.

Video 10. Video che mostra la sequenza di telaio grezzo che è stato elaborato per generare l'immagine STORM in Figura 7D. 10.000 sequenza di frame con una dimensione di 128 x 128 pixel fotogramma, un tempo di esposizione msec 10 e acquisita a 52.5 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere il video 10 .

Discussion

Mostriamo con alcuni campioni semplici e il software di elaborazione temporale liberamente disponibile, è possibile ottimizzare STORM super-risoluzione delle immagini. Questi strumenti e metodi forniranno utili punti di partenza per i nuovi utenti e modi per gli utenti esperti per aumentare la fiducia nei loro microscopi ed il loro uso per studiare le strutture biologiche e cellulari con un dettaglio senza precedenti. Utilizzando una combinazione di campioni con strutture note o ben comprese e un algoritmo che può produrre un numero di parametri utili qualità dell'immagine, quali stime precisione medi, il numero di localizzazione e istogrammi mostra è possibile migliorare la qualità dell'immagine e di avere maggiore fiducia nel processo di imaging STORM. Non esiste una strategia unica per acquisire i dati in quanto vi sono una serie di diverse configurazioni microscopio commerciali e auto-costruito che può essere utilizzato. Inoltre, ci sono molti di preparazione del campione e di immagine fasi di acquisizione che può influenza l'immagine finale quindi con strumenti software e campioni è fondamentale per la comprensione e ottimizzare la qualità delle immagini STORM.

Inoltre, questi protocolli possono fornire modi utili e meno ambigue di risoluzione di eventuali problemi che possono sorgere. Ad esempio il campione destrano è un modo molto utile per identificare se c'è qualche disallineamento fascio laser o illuminazione non uniforme del campione. Se ci sono preoccupazioni che il buffer di commutazione non può lavorare un test visivo molto semplice per vedere se c'è qualche 'lampeggiante' sarà di aiuto. Filamenti di actina sono un modo utile per misurare risoluzione usando paragoni FWHM nonché evidenziare deriva e mislocalization artefatti. Tuttavia, va notato che come metodi super-risoluzione basata localizzazione-può essere densità fluoroforo sensibili, nonostante gli altri fattori, quali tempi di esposizione, frame rate potenze laser e il modo in cui l'immagine viene elaborata, è impossibile assegnare risoluzione di unparticolare microscopio e supporre che tutte le immagini avranno tale risoluzione. Che cosa è possibile, tuttavia, è quello di misurare i vari aspetti della risoluzione come precisioni di localizzazione, il numero medio di localizzazione e deriva ^27. Anche se marker fiduciali non possono essere incorporati in ogni esperimento si può, almeno, essere utilizzato per caratterizzare un sistema di microscopia, il suo ambiente e capire meglio considerazioni operative come ad esempio come è richiesto molto tempo per raggiungere l'equilibrio termico dopo l'avviamento. E correggere la deriva laterale, marcatori fiduciali possono essere utilizzati per caratterizzare e corretta per deriva assiale, anche se questo richiede l'uso di una lente astigmatica e un meccanismo di feedback per correggere la posizione del campione mentre le immagini vengono acquisite ^43. Sistemi di super-risoluzione commerciali comprendono normalmente una sorta di controllo di stabilità o concentrarsi-lock meccanismo, che può essere una soluzione più pratica per la correzione fuoco deriva.

C'è unare alternative non specifico rivestimento del vetro con destrano, come l'utilizzo di coloranti direttamente o altre molecole coniugati, come anticorpi secondari. Una limitazione di questi approcci è che il numero di molecole legate al vetro non è noto. Strutture filamentose alternativi che sono stati utilizzati includono microtubuli ²⁸ e DNA ^21. Tuttavia, la combinazione di dimensioni molto piccole e convenienti reagenti commercialmente disponibili rendono actina un'alternativa interessante, tanto più che la distanza di separazione dei filamenti divergenti o ramificati può anche essere una misura utile di prestazioni del sistema ^27.

C'è spazio per un ulteriore sviluppo dei campioni di prova, nonostante i recenti progressi in questo settore ^28,29,46,47. In particolare, l'imaging multi-colore presenta una serie di sfide in tutti i 3 aspetti principali della rappresentazione, l'etichettatura del campione, acquisizione di immagini (hardware) e software (elaborazione delle immagini e l'allineamento). Ci sono stati ununa serie di pubblicazioni che affrontano questi aspetti ^4-6 ed è quindi chiaro che i campioni e le metodologie di prova appropriati sono fondamentali per generare e affidabile interpretare questi tipi di immagini. Infatti, recentemente è stato dimostrato che dSTORM potrebbe essere utilizzato per prendere due immagini a colori di, e risolvere, la natura altamente simmetrico del complesso del poro nucleare e gli autori suggerito che questo sarebbe un modo ideale per valutare le prestazioni di correzioni aberrazione cromatica ^45. Un altro approccio interessante è l'uso di origami DNA per creare un nanoruler, che crea la possibilità di fluorofori posizionamento a specifiche distanze sub-diffrazione a parte ^46. Questo fornisce un modo di valutare la risoluzione e fare misurazioni della distanza. Tuttavia, l'obiettivo finale è quello di applicare queste tecniche di super-risoluzione per campioni non idealizzate, come le cellule, che sono complesse strutture tridimensionali. In questo caso, una combinazione di più comprensione approfondita di tegli tecnica combinata con strumenti software che aiutano l'utente nella acquisizione dei dati, l'elaborazione in modi appropriati, e di fornire metriche di immagine è probabile che sia la risposta definitiva. ^28,29,47,48

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labtek Imaging chamberglass	Fisher	CBR-166-390E	Preparazione del campione
Microscopio invertito	Olympus	IX71	* Vedi sotto per le alternative
100 X TIRF Obiettivo Lente	Olympus	UAPON 100XOTIRF	* Vedi sotto per le alternative
EMCCD Camera	Andor	iXon 897	* Vedi sotto per le alternative
Laser	640 nmToptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - per l'imaging di coloranti Alexa 647 o Cy5
LabVIEW	National Instruments		*Software di acquisizione (hardware di controllo)
PC	Dell		Windows XP (64 bit), CPU Intel Xeon E5420, 16 GB di RAM *Controllo dello strumento ed elaborazione delle immagini
ImageJ			Analisi ed elaborazione delle immagini http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM	Laser Analytics Group (Cambridge) software		http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Esempio di microscopi			Vedi anche riferimento 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Microscopi			Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternative ai microscopi autocostruiti
Tabella 1. Materiali & Attrezzatura
[header]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
Poli-L-Lisina	Sigma	P4707	1.1; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
Tampone di actina generale	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
Filamenti di actina preformati	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Fallodina-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
Microsfere TetraSpeck (0.1 micron)	Invitrogen	T-7279	3.1
Celle HeLa	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
Pen/Step	Invitrogen	15070063	4.1
Piatti di plastica	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
Formaldeide - Soluzione al 10 % Grado EM	Polysciences	04018-1	4.2
Catalasi	Sigma	C100	5.1
Glucosio ossidasi	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
Glucosio	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
Glicerina	Sigma	G2289	5.1; 5.2
Tabella 2. Reagenti