Articolo metodologico

Isolamento Manuale di cellule staminali derivate da tessuto adiposo da lipoaspirato umani

DOI:

10.3791/50585

⸱

26 settembre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

In questo articolo

Sommario

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Nel 2001, i ricercatori della UCLA hanno descritto l'isolamento di una popolazione di cellule staminali adulte, chiamate cellule o ASC staminali derivate da tessuto adiposo, dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive l'isolamento di ASC da lipoaspirato utilizzando un protocollo digestione enzimatica manuale mediante collagenasi.

Abstract

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Nel 2001, i ricercatori della University of California, Los Angeles, ha descritto l'isolamento di una nuova popolazione di cellule staminali adulte dal tessuto adiposo liposuzione che inizialmente chiamati celle lipoaspirato trasformati o cellule PLA. Da allora, queste cellule staminali sono stati rinominati in cellule staminali derivate da tessuto adiposo o ASC e sono andati a diventare uno dei più popolari popolazioni di cellule staminali adulte nel campo della ricerca sulle cellule staminali e la medicina rigenerativa. Migliaia di articoli ora descrivono l'uso di ASC in una varietà di modelli animali di rigenerazione, compreso rigenerazione ossea, la riparazione dei nervi periferici e ingegneria cardiovascolare. Articoli recenti hanno cominciato a descrivere la miriade di usi per ASC nella clinica. Il protocollo illustrato in questo articolo è descritta la procedura di base per mano e enzimaticamente isolare ASC da grandi quantità di lipoaspirato ottenuti da procedure cosmetiche. Questo protocollo può essere facilmente scalato verso l'alto o verso il basso per alloggiomangiato il volume di lipoaspirato e può essere adattato per isolare ASC dal tessuto grasso ottenuti attraverso abdominoplasties e in altri procedimenti analoghi.

Introduzione

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Nel 2001, una popolazione putativo di cellule staminali multipotenti dal tessuto adiposo è stato descritto nella Tissue Engineering 1 rivista. Queste cellule sono stati dati i nomi trasformati lipoaspirato o PLA cellule a causa della loro derivazione dal tessuto lipoaspirato trasformati ottenuti attraverso la chirurgia estetica. Il metodo di isolamento descritto in questo articolo è stato basato sulle strategie enzimatiche esistenti per l'isolamento della frazione stromale vascolare (SVF) dal tessuto adiposo 2. Il SVF è stata definita come una popolazione minimamente trasformati dei globuli rossi, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti e pre-adipociti che devono ancora aderire ad una cultura substrato tessuto 2, 3. Coltura di questa SVF nel tempo si propone di eliminare molte di queste popolazioni cellulari contaminanti e provocare un aderente, popolazione fibroblastica. Questi fibroblasti sono stati identificati in letteratura per gli ultimi 40 anni ad essere pre-adipociti. Tuttavia, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che queste cellule possedevano mesodermal multipotency e rinominato la popolazione SVF aderenti come cellule PLA. Studi successivi da numerosi altri gruppi di ricerca hanno aggiunto a questo potenziale, proponendo sia endodermico e potenziali ectodermica (per la recensione vedi 4). Da allora, numerosi termini supplementari per queste cellule sono apparsi in letteratura. Al fine di fornire un certo tipo di consenso, il termine di cellule staminali derivate da tessuto adiposo o ASC è stata adottata in occasione della conferenza annuale nd IFATS 2. Come tale, il termine ASC verrà utilizzato in questo articolo.

Il protocollo descritto in questo articolo è una procedura relativamente semplice che richiede attrezzature di laboratorio standard e utilizza reagenti semplici come soluzione salina fosfo-buffered, reagenti mezzi di coltura dei tessuti standard e collagenasi. Si può produrre un gran numero di ASC seconda della quantità di volume del tessuto adiposo di partenza e successiva ctempo ulture. Tuttavia, il trattamento di una tale quantità di tessuto adiposo può presentare alcuni problemi fisici che possono essere attenuato utilizzando questo protocollo. Inoltre, questo protocollo richiede tessuti sterili strutture di coltura e le cappe di biosicurezza approvati, richiedano quindi l'uso di un impianto di coltura tissutale approvato. Questo requisito può anche diminuire l'utilità della popolazione ASC in applicazioni cliniche meno che non siano isolati in buone pratiche di fabbricazione (GMP strutture) approvati progettati per l'isolamento e l'espansione di materiali per uso clinico. In alternativa, sistemi automatizzati in grado di isolare ASC in un sistema chiuso in sala operatoria sarebbe evitare questo problema fondamentale e consentire l'utilizzo immediato di ASC, senza necessità di successiva espansione in vitro. Ad oggi, ci sono sei sistemi automatizzati che sono disponibili in commercio per l'isolamento di cellule da tessuto umano. Questi sistemi possono consentire di isolare unnumero significativo di ASC di grandi quantità di tessuto adiposo subito dopo il suo raccolto. Questi ASC potrebbero poi essere reintrodotti nel paziente per una varietà di scopi rigenerativi, senza che il paziente dover mai lasciare la sala operatoria. In aggiunta a questo protocollo descrive l'isolamento manuale di ASC, un protocollo per l'isolamento automatizzato di ASC utilizzando il sistema Celution è data anche in un altro articolo.

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Protocollo

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Il protocollo qui illustrato descrive l'isolamento manuale di ASC da lipoaspirato ottenuti attraverso procedure cosmetiche usando digestione enzimatica e centrifugazione differenziale. Questo protocollo è stato pubblicato sulla rivista Tissue Engineering nel 2001 1, in cui le cellule risultanti sono stati chiamati celle lipoaspirato trasformati o cellule PLA a causa del loro isolamento da lipoaspirato. Tuttavia, la cella PLA termine è stata sostituita con le derivate da tessuto adiposo Cellule o ASC per dare al settore una sorta di conformità in termini di nomenclatura staminali termine. Le cellule isolate tramite questo protocollo è stato dimostrato da molti disporre di un potenziale mesodermica sia in vitro che in vivo (per recensione vedi 4). Inoltre, i ectodermiche e endodermico potenzialità della ASC sono anche state esplorate 4. La tecnica di isolamento è semplice e lineare e richiede circa un'ora per completare. La cella risultantes sono coltivate in condizioni di coltura tissutale standard. Con il tempo cultura, la popolazione ASC diventa più omogenea, composta da cellule fibroblastiche che si espandono facilmente e mostrano buona vitalità nel lungo termine in coltura.

Nota: I seguenti pezzi di equipaggiamento che sono richiesti sono elencati alla fine di questo articolo. Tutti cristalleria, i media ei reagenti devono essere sterilizzati con autoclave o filtrati attraverso 0.22 micron filtri. Asettiche tessuto tecniche di coltura devono essere seguite in ogni momento. A tal fine, tutti i materiali inseriti nel quadro di biosicurezza devono essere sterilizzati bagnandoli con una soluzione di etanolo al 70% e pulire con tovaglioli di carta puliti.

1. Prima di Harvest, preparare i seguenti:

  1. Sterile 1X fosfo-buffered saline (PBS) per il lavaggio delle lipoaspirato. Preparare circa 1 l di 1x PBS per ogni 100 ml di lipoaspirato. Sterilizzare il PBS e tuttiome raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso. Come opzione, antibiotico / antimicotico può essere aggiunto ad una concentrazione finale di 100 UI / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina e 2,50 ug / ml di amfotericina B una volta che il PBS è raffreddato.
  2. Sterile 0,075-,1% collagenasi di tipo IA (da Clostridium histolyticum) per la digestione enzimatica della lipoaspirazione. Concentrazione dipenderà dalla qualità e sorgente della collagenasi - cioè vs grezzo purificato. Altri tipi collagenasi possono essere utilizzati (tipo ad esempio collagenasi II o IV) a concentrazioni simili. Preparare in PBS 1x e filtro sterile utilizzando un sistema di filtrazione 1.000 ml con un filtro da 0,22 micron (Figura 1A). Tuttavia, possono essere utilizzati anche bottiglie di vetro sterile dotato di un filtro superiore della bottiglia. Preparare e utilizzare a temperatura ambiente. Le soluzioni Collagenase possono essere conservati per il breve termine a 4 ° C fino al momento dell'uso. Non congelare la soluzione di collagenasi in quanto può diminuire la sua attività.
  3. Sterile controllo Medium (CM) per collagenasi inattivazione e coltura della popolazione ASC. Per 500 ml di CM, combinare il seguente: 500 ml di DMEM (4,5 g / L di glucosio, con L-glutammina), 50 ml di siero fetale bovino (inattivato con il calore), 5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI penicillina, 10.000 g / ml la streptomicina). Come opzione, può anche essere aggiunto 5 ml di amfotericina B (250 mg / ml di amfotericina B). È necessaria la filtrazione sterile di questo mezzo se si utilizzano reagenti non sterili. Posizionare il CM a 37 ° C in bagno d'acqua 30 minuti prima dell'uso per riscaldare il mezzo.
  4. Cristalleria Sterile e plasticware per l'isolamento. Autoclave un bicchiere di vetro 1000 ml e lasciar raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso. Inoltre, hanno la seguente Plasticware pronto: pipette sierologiche asettico (5 ml, 10 ml e 25 ml), 50 ml provette da centrifuga, e la coltura di tessuti trattati cultura piatti.

2. Isolamento di ASC da Lipoaspirates

La maggior parte lipoaspirato sono raccolti in un contenitore di aspirazione (vedere Figura 1B) e possono essere costituiti da tre strati distinti: 1) uno strato superiore di olio a causa della lisi degli adipociti maturi, 2) uno strato intermedio di tessuto adiposo, e 3) una fondo, liquido sottonatante contenente soluzione salina e contaminando tipi di cellule come i globuli rossi (RBC). Lo strato superiore dell'olio potrebbe non essere presente in quantità significative. Se presente, deve essere aspirato come contaminazione dell'olio della cultura ASC risultante potrebbe influenzare la vitalità della cultura. Il sottonatante fondo deve essere rimosso prima del trattamento per minimizzare la contaminazione delle culture ASC con globuli rossi. Questo lascerà mezzo, strato di tessuto adiposo, che verrà poi lavato e digerito enzimaticamente per liberare suo cellulare, frazione stromale vascolare (SVF).

  1. Lavare il lipoaspirato: Aprire il contenitore lipoaspirato nella cultura del tessuto hood e decantare con attenzione il lipoaspirato in un bicchiere di vetro da 1 L sterile. Lasciare che gli strati lipoaspirato per separare fino strato di tessuto adiposo è ben separata (Figura 1B).
    1. Aspirare lo strato dell'olio (se presente) con un ago sterile, pipetta di vetro e il sottonatante salina fondo utilizzando una pipetta 10 ml sierologica. Questo rimuoverà la grande maggioranza dei contaminanti globuli rossi e soluzione salina.
    2. Valutare il volume dello strato di tessuto adiposo risultante e aggiungere sterile 1x PBS a un volume uguale. Mescolare l'aspirato con la pipetta utilizzata per l'aspirazione per miscelare il lipoaspirato con PBS. Lasciare i due strati di stabilirsi. Come notato sopra, la 1x PBS può essere completata con antibiotici / antimicotici.
    3. Aspirare il sottonatante con un 10 ml pipetta sierologica.
    4. Continuare a lavare la frazione di tessuto adiposo, come indicato dal passo 2.1.2. e 2.1.3. finché lo strato adiposo ha un colore giallo / oro. Th Aspiraree sottonatante un'ultima volta, lasciando la frazione tessuto adiposo nel bicchiere di vetro. Per assicurare un'adeguata rimozione del sottonatante, permettono agli strati lipoaspirato di stabilirsi per 5 min dopo l'ultimo lavaggio prima e l'aspirazione finale.
  2. Digestione enzimatica del lipoaspirato: Preparare una soluzione di collagenasi 1A sterile come sopra in un'unità di filtraggio. Preparare un volume pari a quello della frazione adiposo e filtro sterile.
    1. Dopo filtraggio della soluzione di collagenasi, scartare l'unità filtro superiore, attenzione versare la frazione adiposo lavati in soluzione di collagenasi e chiudere ermeticamente la bottiglia.
    2. Posizionare la miscela collagenasi / adiposo in un bagno d'acqua a 37 ° e digerire a 37 ° C per 30 min. Agitare delicatamente la miscela collagenasi / adiposo ogni 5-10 minuti e mettere di nuovo in bagno d'acqua. Lo strato di tessuto adiposo dovrebbe assumere un aspetto "liscia" (Figure 1B), in quanto i proventi digestione. Ulteriori tempi di digestione (cioè fino a 2 ore) possono essere usate se il livello di tessuto adiposo appare ancora avere pezzi solidi di grasso all'interno di esso.
  3. Isolamento di ASC: Inserire la miscela collagenasi / adiposo digerito indietro nel cabinet biosicurezza. Assicurati di sterilizzare l'unità filtro con il 70% di etanolo prima di rimettere nell'armadio.
    1. Pipettare 25 ml della sottonatante contenente la SVF in provette da 50 ml per centrifuga sterili.
    2. Aggiungere 25 ml di CM ad ogni provetta. Lasciare il CM per inattivare la collagenasi incubando a temperatura ambiente nell'armadietto per 5 min.
    3. Centrifugare per 10 min a 1200 xg per raccogliere la SVF come pellet.
    4. Nel gabinetto biosicurezza, aspirare il surnatante da ogni provetta. Assicurarsi che lo strato di olio superiore e qualsiasi adipociti galleggianti vengono aspirati con questa surnatante ( Figura 1B).
    5. Unire i pellet SVF in una provetta da centrifuga con 30 ml CM e dividere equamente su due nuovi tubi centrifuga da 50 ml. Centrifugare come al punto 2.3.3. e aspirare il surnatante dai due pellet SVF (non mostrati in figura).
      OPTIONAL: Se lisi è desiderato, risospendere ogni pellet SVF in 10 ml di un tampone di lisi (160 mM NH 4 Cl) e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Centrifugare come al punto 2.3.3. e aspirare il surnatante per produrre pellet SVF (non mostrati in figura).
    6. Unire le due palline SVF in una nuova provetta da centrifuga con 5-10 ml CM (Figura 1B).
    7. Per filtrare le particelle più grandi di tessuto, dispensare il pellet risospeso SVF su un filtro a rete 100 micron posto sulla sommità di una nuova provetta da centrifuga da 50 ml e lasciar filtrare dal flusso di gravità.
    8. Aliquote pipette di risospeso(E filtrata) pellet SVF contenente le ASC sul tessuto-coltura trattati piatti della cultura. Supplemento ogni piatto con un volume adeguato di CM.
    9. Coltivare le cellule in CM per 3-4 giorni a 37 ° C, 5% CO 2 senza cambiamento di media.

Dopo questo periodo coltura iniziale, il mezzo di coltura può essere aspirato e eventuali contaminanti globuli rossi delicatamente rimosso mediante lavaggio con 1XPBS sterili. Sostituire con CM e continuare a cultura ASC come necessario. Il tipo di tessuto piatto di coltura utilizzato e il pellet risospeso SVF è diviso tra questi piatti dipenderà dal numero di cellule desiderate seguente coltura tissutale convenzionale.

3. Caratterizzazione del ASC Popolazione: Citometria a flusso e multilineare Differenziazione

Una volta isolato, la caratterizzazione della popolazione ASC deve essere eseguita. Approcci convenzionali per questo includono flusso cytometria di caratterizzare il profilo antigene CD superficie cellulare delle cellule e nella differenziazione vitro per confermare la loro capacità di differenziazione multilineare. Mentre molteplici linee possono essere valutati in ASC, questo protocollo delinea la differenziazione delle ASC in cellule del adipogenico, osteogenico e linee condrogenici come mezzo di conferma multilineage potenziali mesodermici 5.

In vitro multi-lignaggio differenziazione di ASC

  1. La differenziazione osteogenica di ASC: Prima di induzione, preparare Osteogenica Media (OM) come segue: per una bottiglia da 500 ml di DMEM (4.5 g / ml di glucosio) aggiungere 25,0 ml di FBS (concentrazione finale 5,0%) e 5,0 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI / ml e 10.000 mg / ml concentrazioni finali, rispettivamente). Per questo, aggiungere i seguenti agenti di induzione osteogenici per dare le concentrazioni finali indicate: desametasone (0,1 micron finale), L-acido ascorbico 2-fosfato (50,0 micron finali) E β-glicerofosfato (10.0 mM finale).
    1. Prima di induzione, raccolta e piastra ASC coltivate nel piatto di coltura di tessuti desiderata, in modo da ottenere una confluenza di circa il 50%. Per ogni piatto sperimentale placcato, piatto un piatto aggiuntivo per un controllo non-indotta. Cultura pernottamento in CM.
      Nota: 50% di confluenza è raccomandato per consentire continua proliferazione che possono verificarsi nel corso dell'induzione
    2. Il giorno di induzione, rimuovere il supporto e aggiungere la seguente: OM ai osteogeniche pozzi sperimentali desiderati e CM ai pozzetti di controllo. Il volume di materiale utilizzato dipenderà dalla dimensione del piatto di coltura tissutale. Per 12 piatti così, 1,0 ml di mezzi per pozzetto è sufficiente. Per 6 piatti e, ml 2,0 di media per pozzetto è sufficiente. Per 100 piatti mm, devono essere usati 10,0 ml di supporti per piastra.
    3. Cultura le cellule per un minimo di 14 giorni con i cambiamenti del mezzo adeguato ogni 3-4giorni. Popolazioni ASC Altamente osteogenici possono mostrare segni di extracellulare deposizione minerale più presto sette giorni induzione.
    4. Differenziazione osteogenica (cioè deposizione minerale extracellulare) può essere confermata utilizzando una colorazione istologica von Kossa di fosfato di calcio. Questa macchia produrrà un precipitato marrone-nero identificare la presenza di fosfato di calcio extracellulare (vedere Figura 2).
      Per macchiare con von Kossa reagente:
      1. Rimuovere la OM dalle cellule sperimentali e la CM dalle cellule di controllo
      2. Fissare le cellule per 60 min a 4,0% paraformaldeide preparato in 1x PBS.
      3. Lavare le cellule due volte con PBS 1x.
      4. Incubare le cellule con nitrato d'argento 2,0% (preparato in acqua) al buio per 30 min.
      5. Rimuovere il nitrato d'argento, lavare due volte con acqua distillata e asciugare le cellule.
      6. Esporre le cellule a luce UV per 60 min a sviluppare il calcico precipitato di fosfato.
      7. Lavare le cellule più volte con 1XPBS.
      8. Controcolorare la cella con ematossilina, se lo desideri.
  1. Differenziazione adipogenico di ASC: Prima di induzione, preparare adipogenico Medium (AM) come segue: Per una bottiglia da 500 ml di DMEM (4,5 g / ml glucosio) aggiungere 50,0 ml di FBS (concentrazione finale 10,0%) e 5,0 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI / ml e 10.000 pg / ml concentrazioni finali, rispettivamente). Per questo, aggiungere i seguenti agenti di induzione adipogenico per dare le concentrazioni finali indicate: desametasone (1.0 mM finale), 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX - 0,5 mm finali), indometacina (0,2 mm finali) e insulina (10,0 micron finale ).
    1. Prima di induzione, raccolta e piastra ASC coltivate nel piatto di coltura di tessuti desiderata, in modo da ottenere una confluenza di circa il 80%. Per ogni piatto sperimentale placcato, piastra un'aggiuntaal piatto per un controllo non-indotta. . Cultura pernottamento in CM Nota: differenziazione adipogenico di ASC sembra essere più efficiente con una maggiore confluenza.
    2. Il giorno di induzione, rimuovere il supporto e aggiungere la seguente: AM alle osteogeniche pozzi sperimentali desiderati e CM ai pozzetti di controllo. Il volume di materiale utilizzato dipenderà dalla dimensione del piatto di coltura tissutale. Per 12 piatti e, 1.0.ml di supporti per pozzetto è sufficiente. Per 6 piatti e, ml 2,0 di media per pozzetto è sufficiente. Per 100 piatti mm, devono essere usati 10,0 ml di supporti per piastra.
    3. Cultura le cellule per un minimo di 14 giorni con variazioni del mezzo appropriato, ogni 3-4 giorni. Popolazioni ASC Altamente adipogenico possono mostrare segni di formazione di vacuoli di lipidi più presto sette giorni induzione.
    4. ASC fase di differenziazione adipogenico svilupperanno più vacuoli lipidici che possono essere facilmente visualizzabili al microscopio ottico. Inoltre, differenziazione adipogenica puòessere confermati utilizzando un colorante istologico Oil Red O che si accumulano all'interno di questi vacuoli (vedi figura 2).
      Per macchiare con Oil Red O:
      1. Rimuovere il supporto dalle cellule sperimentali e di controllo e fissarli per 60 minuti con un fissativo calcio formale del 10%. Per preparare questa fissativo, unire la seguente: acqua 1,0 g di CaCl 2, 25,0 ml 16% paraformaldeide (4,0% finale) e 75,0 ml di acqua distillata.
      2. Lavare le cellule due volte con PBS 1x.
      3. Lavare le cellule brevemente con etanolo al 70%.
      4. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 min con la soluzione Oil Red O. Per preparare la soluzione Oil Red O, sciogliere 2,0 g Oil Red O polvere in 50,0 ml di etanolo al 70% e 50,0 ml di acetone.
      5. Lavare le cellule con etanolo al 70% e poi con acqua di rubinetto.
      6. Visualizza le cellule subito dopo colorazione dovuta alla dissolvenza della colorazione nel tempo.
  1. Differenziazione condrogenico di ASC: differenziazione condrogeniche è ottenuta attraverso una tecnica di coltura ad alta densità denominato "cultura Micromass". Prima di cultura, preparare condrogeniche Media (CHM) come segue: per una bottiglia da 500 ml di DMEM (4.5 g / ml di glucosio) aggiungere 5,0 ml di FBS (concentrazione finale 1%) e 5,0 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI / ml e 10.000 mg / concentrazioni finali ml, rispettivamente). Per questo, aggiungere i seguenti agenti di induzione condrogeniche per dare le concentrazioni finali indicate: L-ascorbico-2-fosfato (50,0 mcg / ml finale), insulina (6,25 mg / ml finale), transferrina (6,25 mg / ml finale) e TGFβ1 (10,0 ng / ml).
    1. Raccogliere le ASC e centrifugare per 5 min a 1200 xg per far sedimentare le cellule. Contare le cellule per determinare la densità della sospensione cellulare.
    2. Per preparare i pellets MICROMASS, preparare due sospensioni cellulari: una sospensione sperimentale preparato in ChM ad una densità di 1 x 10 7 cellules / ml e una sospensione bianco preparato in CM ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml.
      1. Posizionare 10,0 microlitri "goccioline" della sospensione cellulare in singoli pozzetti di un piatto multi-pozzetto. Lasciare aderire per 2-3 ore a 37 ° C.
      2. Sovrapporre delicatamente le gocce placcate sia con ChM o CM facendo attenzione a non dissociare le cellule.
      3. Coltivare le cellule per un massimo di 14 giorni in ChM o CM con variazioni in terreno ogni 3-4 giorni. Cellule coltivate in ChM condenserà tutto questo tempo per formare un Micromass pellet ad alta densità con poco o nessun cellule in un monostrato circostante. Cellule di controllo coltivate non subire questa condensazione e molti saranno trovati come un monostrato.
      4. Per confermare condrogenesi, fissare le palline per 15 min a 4,0% paraformaldeide (preparati in 1x PBS) a temperatura ambiente. Colorare per la presenza di proteoglicani solfati utilizzando una macchia blu istologico alcian.
        Per colorare usando Alcian Blu:
        1. Lavare il papellets raformaldehyde fisso una volta in 1x PBS.
        2. Incubare le pellets in 0,1 N HCl (pH 1,0) per 5 min di abbassare il loro pH.
        3. Rimuovere l'HCl e aggiungere 1% alcian reagente blu (preparato in 0,1 N HCl, pH 1,0). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
        4. Rimuovere il alcian reagente blu e lavare il pellet con 0,1 N HCl (pH 1.0) per rimuovere l'eccesso macchia.
        5. Lavaggi supplementari con acqua di rubinetto può essere utilizzato per ridurre la colorazione di fondo.
        6. In alternativa, i pellet MICROMASS possono essere raccolti, fissati durante la notte in 10% formalina, inclusi in paraffina e le sezioni colorate per Alcian blu.

4. Citometria a flusso Caratterizzazione di ASC

Caratterizzazione del profilo antigene CD superficie cellulare può essere realizzata mediante citometria a flusso convenzionale.

  1. Preparazione di ASC per la citometria a flusso: Priorall'analisi, preparare un Citometria a flusso Buffer (FCB), composto dal seguente: 1,0% BSA, 2,0% FBS e il 0,025% saponina preparato in 1x PBS.
    1. Raccogliere le ASC e centrifugare le cellule per 5 min a 1200 xg per produrre un pellet.
    2. Risospendere le cellule in sterile 1XPBS e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Determinare la densità cellulare della sospensione.
    3. Dividere la sospensione fino in aliquote di 5 x 10 5 cellule totali e centrifugare a pellet.
    4. Rimuovere il surnatante PBS e fissare le cellule per 60 minuti a -20 ° C con un eccesso di ghiacciata etanolo al 70%. Se necessario, queste cellule possono essere conservate in questo etanolo al 70% in un congelatore a -20 ° C fino al momento dell'uso.
    5. Dopo la fissazione, aspirare accuratamente l'etanolo e lavare delicatamente il pellet due volte con un eccesso di FCB. Per lavare:
      1. Aggiungere un eccesso di FCB e risospendere delicatamente il pellet.
      2. Centrifugare per 5 minuti a 1200 xg per raccogliere le cellule asa pellet.
      3. Con attenzione aspirare il surnatante FCB.
      4. Ripeti.
    6. Rimuovere la finale di lavaggio FCB surnatante da ciascuna aliquota e risospendere in 100 ml di FCB. Aggiungere l'anticorpo primario fluorocromo coniugato desiderato mediante diluizione consigliata del produttore. Incubare le cellule in ghiaccio con l'anticorpo per 30 min.
      Nota: Se gli anticorpi primari fluorocromi coniugati non sono disponibili, possono essere utilizzati anticorpi primari non coniugati.
    7. Per ogni fluorocromo utilizzato (ad esempio FITC, PE), incubare una aliquota di cellule con 100 ml contenente FCB IgG isotipo-abbinato come controllo negativo.
    8. Incubare un'aliquota di 100 FCB ml contenente anticorpi come un ulteriore controllo.
    9. Lavare ogni aliquota di cellule due volte con FCB come dettagliato nella fase 4.1.5. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le aliquote in 100 ml di FCB e procedere con l'analisi del flusso.
      Nota: Se sono stati usati anticorpi primari non coniugati: Dopo questa fase di lavaggio incubare le aliquote in ghiaccio per 20 min con FCB completato con l'anticorpo secondario coniugato con fluorocromo appropriato utilizzando diluizione consigliata del produttore. Lavare due volte come descritto al punto 4.1.5.
  2. Analisi dei flussi di ASC: Per l'analisi del flusso, un minimo di 10.000 eventi va conteggiato. Controlli senza macchia e isotipici-abbinato devono essere utilizzati per impostare porte da forward scatter (FSC) e side scatter (SSC). Per questo, i controlli presenti anticorpi (cioè non colorati) del passaggio 4.1.8 dovrebbero essere usati per eliminare detriti e ASC morti. I controlli IgG isotipici corrispondenza del passo 4.1.7. dovrebbero essere utilizzati per stabilire le aree di fluorescenza positiva.

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Risultati

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Lo schema di protocollo di cui sopra descrive un metodo enzimatico manuale per l'isolamento di un SVF da un ampio campione lipoaspirato volume. All'interno di questo SVF sono numerose popolazioni cellulari, tra cui il ASC. Numerosi studi suggeriscono che la coltura di questo SVF in condizioni di coltura di tessuti normali selezionerà per una popolazione fibroblasti aderenti rischia di essere composta principalmente di tipo ASC. Coerentemente con questo, abbiamo dimostrato, mediante citometria a flusso ed immunofluoresce...

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Discussione

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Il tessuto adiposo per l'isolamento di ASC può venire in molte forme: da pezzi solidi di tessuto ottenuti con la resezione o liposuzione in piccoli pezzi ottenuti attraverso sia l'estrazione siringa o liposuzione aspirazione assistita (cioè liposuzione). Se le cellule più SVF (e quindi ASC) possono essere ottenuti da campioni adiposi resecati o aspirati non è chiaro come gli studi contrastanti sono stati presentati 16, 17. E 'possibile che sia sotto forma di tessuto adiposo è più adatto p...

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Dichiarazioni

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Gli autori di questo manoscritto sono co-inventori su un brevetto di proprietà di The Regents dell'Università della California e in licenza a Cytori Therapeutics.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare e ringraziare quei personale di ricerca aggiuntivi che hanno contribuito allo sviluppo del protocollo descritto e il suo isolamento di ASC, tra cui: Dr. H. Peter Lorenz, MD, il dottor Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Alfonso Zeni, PhD, e il dottor John Fraser, PhD. I risultati presentati sono stati finanziati, in parte, da borse di ricerca dal National Institutes of Health, compresi i NIAMS e NIDCR Istituti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagent
DMEM (Dulbecco’ s Modifica di Eagle’ MediatechCellgro10-013-CVcon 4,5 g/ml di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio
Penicillina/StreptomicinaMediatech Cellgro30-002-CI10.000 UI/ml penicillina/10.000 μ g/ml streptomicina
Amfotericina BMediatech Cellgro30-003-CF250 μ g/ml amfotericina B
10X PBS (soluzione salina fosfo-tamponata)Mediatech Cellgro25-053-CIsenza calcio, senza magnesio
Tripsina/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0,25 % tripsina/2,21mM EDTA
Collagenasi tipo IA (da Clostridium histolyticum)Preparato grezzo SigmaC2674; < 125 unità di digestione del collagene/mg solido
FBS (Fetal Bovine Serum) inattivato a caldoGemini Bioproducts100106fonte USDA, inattivato a calore
Pipette sierologiche da 10 mlGenesee Scientific12-104
Pipette sierologiche da 25 mlGenesee Scientific12-106
Provette da centrifuga in polipropilene da 50 mlGenesee Scientific21-106
piastre per coltura tissutale da 100 mmGenesee Scientific25-202
piastre per coltura tissutale da 150 mmGenesee Scientific25-203
Unità filtranti Stericup da 500 mlMembrana MilliporeSCGPU05REPES, 0,22 μ Filtri cellulari a poro
m FisherBrand22-363-549100 μ m rete di nylon
desametasone - solubile in acquaSigmaD-2915
acido L-ascorbico 2 fosfatoSigmaA-8960
β-glicerofosfato sale disodico SigmaG-9422noto anche come glicerofosfato
insulinaSigmaI-6634a base di indometacina pancreas bovina
SigmaI-7378
apo-transferrinaSigmaT-4382
TGFβ 1R& D Systems240-B-002umano ricombinante
Rosso OSigmaO-0625
Blu AlcianoSigmaA-5268
Nitrato d'argentoSigmaS-0319
Acido cloridricoFisher ScientificA144
ParaformaldeideFisher Scientific30525-89-4fornito come stock
[intestazione]
Attrezzatura necessaria
Classe II A/B Cappa di biosicurezzaThermo Scientificassicura che la cappa sia dotata di linee di vuoto per l'aspirazione
Centrifuga da bancoHermle LabnetZ383Rotore oscillante per provette da 50 ml richiesto, capace di 1200xg
d'acqua Fisher Scientific IsotempS52602Qcapacità di 5-10 litri, capace di 37C
Pipette Aid AutomatizzateDrummond Pipette Aid XL4-000-105
CO2 IncubatoreThermo ScientificForma 310calore diretto o con rivestimento ad acqua
olio del 16 %Bagno a

Riferimenti

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