Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.
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Articolo metodologico
Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Neutrofili sono cellule critiche effettrici del sistema immunitario innato. Sono rapidamente reclutati ai siti di infiammazione acuta e esercitano effetti protettivi o patogeni seconda del milieu infiammatorio. Tuttavia, nonostante il ruolo indispensabile dei neutrofili nel sistema immunitario, la comprensione dettagliata dei fattori molecolari che mediano gli effetti effettrici e immunopatogenici neutrofili 'in diverse malattie infettive e le condizioni infiammatorie che ancora manca, in parte a causa della loro breve emivita, le difficoltà con la gestione di questi celle e la mancanza di protocolli sperimentali affidabili per ottenere un numero sufficiente di neutrofili per studi funzionali a valle e gli esperimenti di trasferimento adottivo. Pertanto, metodi semplici, veloci, economici e affidabili sono altamente desiderabile per la raccolta di un numero sufficiente di neutrofili del mouse per valutare funzioni quali la fagocitosi, l'uccisione, la produzione di citochine, degranulazione e il traffico. A tal fine,vi presentiamo un protocollo riproducibile gradiente di densità centrifugazione a base, che può essere adattato in qualsiasi laboratorio per isolare un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità. Inoltre, vi presentiamo un semplice protocollo che utilizza coloranti CellTracker per etichettare i neutrofili isolati, che possono poi essere trasferiti adoptively in topi riceventi e monitorati in diversi tessuti per almeno 4 ore post-trasferimento in citometria a flusso. Usando questo approccio, l'etichettatura differenziale dei neutrofili da topi wild-type e gene-deficienti con diversi coloranti CellTracker può essere impiegato con successo per eseguire studi di ripopolamento della concorrenza per valutare il ruolo diretto di geni specifici nel traffico di neutrofili dal sangue nei tessuti bersaglio in vivo .
Introduzione
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nell'uomo. Essi sono la principale componente cellulare del sistema immunitario innato e ad agire come una prima linea di difesa contro l'invasione dei microrganismi. I pazienti con neutropenia acquisita e immunodeficienze primarie che interessano i numeri dei neutrofili e / o funzione di sviluppare infezioni invasive potenzialmente letali batteriche e fungine, mettendo in evidenza l'importanza di queste cellule in serie della difesa 1. Riconoscimento immune di patogeni nel sito dell'infezione dai loro cognate di riconoscimento di recettori risultati nella induzione di una risposta immunitaria in....
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Protocollo
1. Isolamento del midollo osseo di topo cellule
- Euthanize topo, utilizzando il protocollo di cura degli animali dell'istituzione comitato-approvato e spruzzare la superficie degli animali con il 70% di etanolo.
- Fare una incisione della pelle nella metà addome e togliere la pelle dalla parte distale del topo compresa la pelle che copre le estremità inferiori.
- Tagliare i muscoli delle estremità inferiori con le forbici e dislocare attentamente dell'acetabolo dall'articolazione dell'anca, evitando di rompere la testa del femore.
- Togliere i muscoli rimanenti dal femore e tibia con un bisturi e forbici e separare il....
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Risultati
Questo protocollo è ottimizzato per la raccolta di cellule di midollo osseo di topo e la successiva separazione di neutrofili dal queste cellule mediante centrifugazione in gradiente di densità utilizzando commercialmente disponibili mezzi di separazione cellulare HISTOPAQUE. Neutrofili isolati usando questo metodo può essere utilizzato per una varietà di valle studi ex vivo e funzionale per esperimenti trasferimento adottivo in topi riceventi.
La resa tipica di raccolta delle cellu.......
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Discussione
Qui vi presentiamo un semplice protocollo affidabile, veloce ed economico per l'isolamento di un gran numero di neutrofili dal midollo osseo di topi con elevata purezza e vitalità utilizzando un approccio di centrifugazione in gradiente di densità. Quando questo protocollo è eseguita correttamente, ~ 6-12 × 10 6 neutrofili possono essere recuperati da un mouse non infetto e fino a ~ 30-40 × 10 6 neutrofili possono essere isolati da un topo dopo l'infezione 6. I neutrofili isolati.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Divisione di ricerca intramurale del Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID), National Institute of Health (NIH), Stati Uniti d'America.
Tutti i topi sono stati mantenuti ad una Associazione americana per l'accreditamento del Laboratorio stabulario accreditato cura degli animali presso l'Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) e alloggiati in conformità con le procedure descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio sotto gli auspici di un protocollo approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del NIAID.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| RPMI 1640 1X con L-glutammina e 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Siero Fetale Bovino (Inattivato a Caldo) | GemCell | 100500 | |
| Penicillina/Streptomicina (10.000 unità di penicillina / 10.000 mg/ml di streptococco) | GIBCO | 15140 | |
| 0,5 M EDTA | Qualità Biologica Inc | 351-027-101 | |
| Cloruro di sodio 0,2% e 1,6% | JT Baker | 3624 | Soluzioni di cloruro di sodio preparate utilizzando acqua distillata e filtrate sterili |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 deve essere portato a 18-26 gradi ° C prima dell'uso |
| Sterile filtrato Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 deve essere portato a 18-26 gradi C prima dell'uso |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio | Cellgro | 210-40-CV | |
| Alcool etilico (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-clorometilfluoresceina diacetato) | Invitrogen | C-7025 | Preparare soluzioni stock di 10 mM in DMSO, aliquotare e conservare a -80 ° C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(e 6)-4-Clorometil benzoile ammino tetrametilrodamina) | Invitrogen | C-2927 | Produrre soluzioni madre di 10 mM in DMSO, aliquotare e conservare a -80 gradi; C |
| Anti-topo CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-topo Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-topo Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-topo CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Utilizzare a diluizione 1:100 |
| LIVE/DEAD Kit di colorazione di cellule morte blu fissabili | Sonde molecolari | L-23105 | Utilizzo a diluizione 1:1000 |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Soluzione di paraformaldeide, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Tabella 1. Reagenti per l'isolamento, l'etichettatura e il monitoraggio dei neutrofili trasferiti in modo adottivo. | |||
| Materiali | |||
| C57BL/6 mouse | Taconic | ||
| Provette da centrifuga da 15 ml | Corning | 430053 | |
| Provette da centrifuga da 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| Pipette sierologiche da 25 ml | Celltreat | 229225B | |
| Pipette sierologiche da 10 ml | Celltreat | 229210B | |
| Pipette sierologiche da 5 ml | Celltreat | 229205B | |
| Pipette Pasteur (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| Siringhe da 12 ml Kendall | monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 pollici Aghi (aghi di scorrimento di precisione) | BD | 305122 | |
| Filtri per celle da 100 mm | BD Falcon | 352360 | |
| Piastre di Petri battericida | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Strumenti per la dissezione di topi (forbici, pinze, bisturi) | Strumenti di ricerca biomedica | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Strumenti sterilizzati prima dell'uso |
| Equipment | |||
| Cappa per coltura tissutale | The Baker Company | SG403 | |
| Centrifuga refrigerata | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 gradi C agitazione bagno d'acqua | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Tabella 2. Elenco dei materiali e delle attrezzature utilizzate in questo protocollo. |
Riferimenti
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22
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Ristampe e permessi
