Il miofibroblasti è una cellula stromale influente del tratto gastrointestinale che regola importanti processi fisiologici in stati normali e patologici. Descriviamo una tecnica che consente l'isolamento dei miofibroblasti primarie sia da mouse e tessuti del colon umano, che può essere utilizzato per la sperimentazione in vitro.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il miofibroblasti è una cellula stromale del tratto che sta guadagnando una notevole attenzione per il suo ruolo fondamentale in molte funzioni GI gastrointestinale (GI). Mentre diverse linee cellulari miofibroblasti sono disponibili in commercio per studiare queste cellule in vitro, i risultati della ricerca di una linea di cellule esposte a condizioni di coltura cellulare sperimentali hanno delle limitazioni intrinseche dovute al carattere eccessivamente riduttiva del lavoro. L'uso di miofibroblasti primarie offre un grande vantaggio in termini di conferma risultati sperimentali individuati in una linea cellulare. Isolamento di miofibroblasti primarie da un modello animale consente lo studio dei miofibroblasti in condizioni che imitare maggiormente lo stato di malattia in fase di studio. Isolamento di miofibroblasti primari dal tessuto del colon umano fornisce senza dubbio i dati sperimentali più rilevanti, dal momento che le cellule provengono direttamente dai pazienti con la malattia di base. Descriviamo una tecnica ben consolidata che può essere utilized isolare myofibroblasts primarie sia da mouse e tessuti del colon umano. Queste cellule isolate sono stati caratterizzati per essere alfa-actina del muscolo liscio e vimentina-positive, e desmina-negativo, in linea con miofibroblasti intestinali subepiteliali. Cellule myofibroblast primarie possono essere coltivate in coltura cellulare e utilizzati per scopi sperimentali su un numero limitato di passaggi.
Introduzione
La regolazione della funzione gastrointestinale del tratto (GI) comporta complesse, interazioni dinamiche tra lo strato mucoso e il suo mesenchima sottostante. Queste interazioni normalmente servono a mantenere l'omeostasi ma possono anche portare allo sviluppo di stati di malattia in condizioni patologiche 1. Miofibroblasti sono una sottopopolazione di cellule stromali situati soggiacente allo strato epiteliale che comunicano in modo paracrino con circostante sottopopolazioni di cellule per regolare un numero di processi tratto GI critici che includono rigenerazione della mucosa, riparazione e fibrosi 2.
La line....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Ottenere Colon Tissue
Mouse
Un protocollo per eseguire esperimenti su animali, specificando le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, è stato presentato e approvato dal nostro ufficio istituzionale di Animal Research Vigilanza.
- Euthanize il mouse con isoflurano inalato seguita da dislocazione cervicale.
- Effettuare una incisione mediana ventrale, ritrarre il piccolo intestino di distanza e identificare il colon. Ritrarre la vescica e dell'utero (se presente) lateralmente e identificare l'osso pubico e tagliare con forbici pregiati per esporre il retto.
- Sezionare il mes....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Una volta isolato, miofibroblasti umani primari possono essere coltivate in coltura cellulare ed utilizzati per un numero limitato di passaggi (fino a passaggio 4). Queste cellule sono caratterizzate come un liscio-actina muscolare e vimentina positivo, e desmin-negativi (Figura 1A), in linea con intestinali myofibroblasts subepiteliali 5,7. Essi hanno anche una caratteristica stellato morfologia (Figura 1B). Miofibroblasti primari possono poi essere utilizzati per confermare.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La tecnica generale è simile usando il mouse o colon umano. Questa tecnica può essere utilizzata per isolare miofibroblasti dal piccolo intestino. I dettagli specifici per l'isolamento dei miofibroblasti da 1. mouse e 2. colon umano sono discussi di seguito.
1. Topo Colon
Irrigazione del colon mouse viene facilitata collegando un 4, 16 G Popper ago smussato-end a un'estremità del colon. Questo aiuta anche durante il taglio del colon longitudinalmente. È poss.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant 5KO8DK085136-02 a JY.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda Numero di catalogo | Commenti (opzionale) | |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO# | 17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper aghi smussati | Fisher | #14-825-16K |
Riferimenti
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in healt....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
