Controllo quantitativo e temporale di ossigeno Microenvironment al Islet Single Level

Summary

Controllo dell'ossigeno microfluidica conferisce più di una semplice comodità e velocità su camere ipossiche per esperimenti biologici. Soprattutto quando attuata tramite diffusione attraverso una membrana, ossigeno microfluidica può fornire liquido simultanea e modulazioni di fase gas a livello di microscala. Questa tecnica permette di esperimenti multi-parametriche dinamiche critica per lo studio isolotto fisiopatologia.

Abstract

Ossigenazione simultanea e monitoraggio di glucosio stimolo-secrezione di fattori di accoppiamento in una singola tecnica è fondamentale per la modellazione stati patofisiologici di isolotto ipossia, soprattutto in ambienti di trapianto. Tecniche camera ipossiche standard non possono modulare sia stimolazioni Allo stesso tempo, né fornire un monitoraggio in tempo reale dei fattori di accoppiamento stimolo-secrezione di glucosio. Per far fronte a queste difficoltà, abbiamo applicato una tecnica microfluidica multistrato di integrare sia acqueo e modulazioni in fase gas tramite una membrana di diffusione. Questo crea un panino stimolazione attorno agli isolotti microscaled all'interno del polidimetilsilossano trasparente periferica (PDMS), consentono il controllo dei suddetti fattori di accoppiamento tramite microscopia a fluorescenza. Inoltre, l'ingresso del gas è controllato da una coppia di microdispensers, fornendo quantitativi, modulazioni sub-minute di ossigeno tra 0-21%. Questo ipossia intermittente viene applicato a indagare su un nuovo fenomeno di isolat precondizionamento. Inoltre, armati di microscopio multimodale, siamo stati in grado di guardare il calcio dettagliate e dinamiche dei canali K _ATP durante questi eventi di ipossia. Noi immaginiamo ipossia microfluidica, in particolare questo simultanea tecnica a due fasi, come un valido strumento per studiare isole così come molti ex vivo tessuti.

Introduction

Ipossia dinamica è importante in biologia, in particolare per trapianti di isole

Ipossia dinamico è un importante fisiologica così come parametro fisiopatologico in molti tessuti biologici. Variazione ossigeno, per esempio, è un segnale di sviluppo potente nell'angiogenesi. Inoltre, i modelli spaziali e temporali in ipossia modulano HIF1-alfa e giocano un ruolo in malattie come il cancro del pancreas. L'ipossia è anche un fattore di confusione che interessano gli esiti del trapianto di isole pancreatiche. Recentemente, temporalmente oscillazioni di ipossia, o ipossia intermittente (IH) hanno dimostrato benefici in "precondizionamento" isolotti ^1. Tuttavia, gli effetti di ipossia sia statici e transitori su isolotto fisiologia devono ancora essere ben compreso o studiato, principalmente a causa della mancanza di strumenti adeguati per controllare microambiente di isolotto.

Isolotti sono ben vascolarizzata in vivo

Isole pancreatiche sono 50-400 M aggregati sferoidali di cellule endocrine, comprese cellule beta e alfa-cellule che sono responsabili per l'omeostasi del glucosio; 56. Quando isolotti sono esposti a stimolatorio glucosio nel sangue, l'assorbimento e la glicolisi piombo per la produzione di ATP, che apre potassio ATP-sensibili (K _ATP) canali e risultati in ingresso di calcio che innesca l'esocitosi di granuli di insulina. L'ossigeno è importante per guidare questo processo fortemente metabolico e la secrezione di insulina è significativamente influenzato dalla dinamica del flusso di sangue e ossigeno in aggiunta a gradienti di glucosio. Isolotti facilmente eseguire questa risposta di glucosio-insulina in vivo in quanto sono altamente perfusi nel pancreas, ciascuno entro una lunghezza di cella da un vaso capillare. Tuttavia, la fitta rete di capillari intraislet viene rimosso dalla collagenasi durante isolotto di isolamento ^2,3. Di conseguenza, sia l'ossigeno e nutrienti forniture sono vincolati ad un perimetro 100 micron a causa di limitazioni di diffusione.

successo step "> Le tecniche attuali sono limitate a ricreare isolotto microambiente

Ossigeno e glucosio dinamiche nativi Ricreare di isole, la chiave per modellare condizioni fisiologiche e fisiopatologiche, è difficile da raggiungere con le camere ipossiche standard che richiedono il flusso elaborata e privi di monitoraggio continuo delle funzioni insulari. Inoltre, le terapie di trapianto per il diabete di tipo I espongono isole isolate all'ipossia nel sistema portale epatico ⁴ che ha una più bassa pO ₂ (<2%, 5-15 mmHg) rispetto al pancreas fisiologica (5,6%, 40 mmHg). Post-trapianto, gli innesti isole prendono due o più settimane da rivascolarizzati. È stato dimostrato che l'esposizione ipossico altera glucosio-insulina meccanismo di accoppiamento di isolotto. Tra i fattori di accoppiamento stimolo-secrezione, segnalazione di calcio, potenziali mitocondriali, e di insulina cinetica può essere facilmente monitorato mediante microfluidica. Il nostro precedente tecnica di microfluidica dimostrato questo remonitoraggio al-tempo con una precisa modulazione del microambiente acquosa intorno singolo isolotto ^5,6. Tuttavia, la quantificazione di danno ipossico di isolotto è ostacolata dalla mancanza di tecniche di stimolazione e il monitoraggio simultaneo. Pertanto, la combinazione di controllo microfluidica di ossigeno e di monitoraggio isolotto in grado di migliorare gli studi di ipossia isolotto.

Microfluidics possono ricreare e modulare il microambiente acqueo e ossigeno

La tecnica standard per gli studi dei tessuti e la cultura ipossia è stata basata su camere ipossiche. In generale, le camere ipossiche forniscono concentrazioni singole di ossigeno con tempi di equilibrazione a ~ 10-30 min, incompatibili con minuti in scala ipossia dinamico. Due recenti studi utilizzati piccole camere su misura per l'esposizione ipossia intermittente sul complesso topi, con risultati contrastanti sulla glucosio-indotta risposta insulinica ^7,8. Tenete a mente che l'intero livello animale, l'ossigeno respirato non è direttamente tranprevisto per isolotto capillare pO _2, a causa di controlli nel sistema respiratorio. Inoltre, questi studi non hanno livelli di ossigeno standardizzati, né forniscono misure in tempo reale a livello tissutale di isolotti.

D'altra parte, microfluidica ossigeno possono superare queste limitazioni controllando ossigeno attraverso reti di canali gas. Inoltre, microfluidica è compatibile con imaging dal vivo durante la modulazione di ossigeno, una prodezza momento non è possibile con le camere ipossiche standard. Un certo numero di questi nuovi approcci microfluidica utilizzare la permeabilità ai gas di polidimetilsilossano a dissolversi concentrazioni di ossigeno in microcanali che scorrono media negli cellule bersaglio ^9-14. Questi dispositivi hanno integrato anche più discrete concentrazioni di ossigeno, sensori di ossigeno fluorescenza basato, e persino la generazione di ossigeno chimico on-chip.

Microfluidica basata solvatazione liquidi hanno difficoltà a mantenere stabili, continue sfumature come it dipende miscelazione convettiva che è sensibile alle condizioni di flusso. In confronto, la tecnica usata qui si concentra sulla riduzione percorso di diffusione di apporto di ossigeno. La solvatazione gas e flusso di taglio sono eliminati diffondendo direttamente ossigeno attraverso una membrana seminati con cellule o tessuti insulari. Questo elimina le microfluidica aggiuntivi necessari per controllare solvatazione e impedisce shear stress inutile per le isole, che a sua volta può innescare il rilascio di insulina. Questa piattaforma è stata utilizzata per dimostrare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) up-regulation agli estremi sia iperossici e ipossia (2-97% O ₂₎ in coltura cellulare ^1,15. A causa della fornitura diretta di ossigeno e la rimozione di flusso di taglio, la nostra piattaforma basata sulla diffusione fornisce la soluzione ottimale per studiare microfluidica isolotto ipossia.

Stimolo e monitoraggio multimodale

Microfluidica basata Diffusion-porta anche vantaggi aggiuntivi quando adattato per lo studio mi dell'isolottocrophysiology. Utilizzando una membrana come barriera di diffusione, il liquido può essere isolata dalle modulazioni di ossigeno, permettendo controlli di stimolazioni glucosio acquose indipendentemente da stimoli ipossici. Questo crea una stimolazione simultanea sandwich che spazialmente pin-punti di consegna per le isole. Inoltre, poiché il gas è temporalmente modulata tramite microiniettori computerizzati, possiamo modulare la concentrazione di ossigeno 21-0% digitalmente con il tempo transitorio meno di 60 sec. I controlli dinamici del microambiente ossigeno e glucosio al microscopio permettono un protocollo multimodale in tempo reale che non sarebbe possibile o straordinariamente ingombrante utilizzando camere ipossiche standard. Utilizzando questo dispositivo, segnalazione del calcio (Fura-AM), potenziali mitocondriali (Rodamina 123), e la cinetica dell'insulina (ELISA) sono stati monitorati per fornire un quadro completo della risposta dinamica glucosio-insulina sotto ipossia.

Protocol

1. Preparare le isole di topo

1. Sezionare topi C57BL / 6 e isolare isolotti da digestione con collagenasi e separazione gradiente di densità Ficoll. (Fare riferimento ad articoli Giove riferimento in ^2,3).
2. Incubare isolotti in mezzo RPMI-1640 contenente 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 20 mM HEPES in piastre Petri (37 ° C, 5% CO _2). Post-isolamento, la cultura isolotti per 24 ore prima di utilizzare negli esperimenti. Utilizzare le isole entro 1-2 giorni per garantire risultati coerenti.

2. Rendere la piattaforma Microfluidic

1. Generare le geometrie microstruttura sulle fotomaschere di trasparenza per ogni strato del dispositivo: 1) entrata e di uscita, 2) strato microfluidica glucosio con camera di perfusione (8 mm di diametro x 3 millimetri, 150 ml), 3) 200 micron membrana con pozzetti (500 micron di diametro, 100 micron di profondità), e 4) strati microfluidici gas.
2. Per fabbricare il livello di ingresso e di uscita, versare degassificate, PDMS premiscelati aun'altezza di 1,5 mm di un piatto vuoto Petri e di indurimento a 80 ° C per 2 h. Punch 2 millimetri di diametro di ingresso / uscita porti.
3. Per fabbricare lo strato microfluidica glucosio, girare due strati di 350 um SU8-2150 per formare un unico strato 700 micron su un 4 in wafer di silicio.
   1. Esporre luce UV attraverso la fotomaschera opportuno trasferire modello microcanali sul SU8 dopo lo sviluppo, producendo un 700 micron maestro di altezza.
   2. Versare sgassato, PDMS premiscelati su questo maestro ad un'altezza di 3 mm e curare a 80 ° C per 2 ore. Tagliare questo PDMS a forma con una lama di rasoio.
   3. Punzone 2 mm di diametro porte di ingresso / uscita e la camera di 8 mm di diametro.
4. Per fabbricare la membrana 200 micron con pozzetti, girare SU8-2100-100 micron. Applicare lo stesso UV-litografia per trasferire i modelli di pozzetti su questo 100 micron maestro di altezza.
   1. Spin degassificato, premiscelati PDMS su questo maestro a 900 rpm per 30 sec e cura a 80 ° C per 10 min. Spisecondo strato na sulla parte superiore del primo utilizzando le stesse condizioni, con un conseguente micron membrana PDMS 200 contenente modelli di micropozzetti.
   2. Punch 2 millimetri di diametro porte di ingresso / uscita attraverso questa membrana
5. Per fabbricare il livello microfluidica gas, girare SU8-2100-100 micron. Applicare lo stesso UV-litografia per trasferire i modelli microfluidica gas su questa 100 micron maestro di altezza.
   1. Versare sgassato, PDMS premiscelati su questo maestro ad un'altezza di 1,5 mm e curare a 80 ° C per 2 ore. Tagliare il PDMS per modellare con una lama di rasoio.
   2. Punch 2 millimetri di diametro porte input / output attraverso questo strato
6. Per legare gli strati multipli, prepararli mediante pulitura con nastro adesivo, esponendo a corona arco, e poi allineare manualmente nel seguente ordine.
   1. Fissare la membrana allo strato inferiore con gas micropozzetti rivolto verso l'alto.
   2. Fissare la microfluidica glucosio in cima alla membrana micropozzetti.
   3. Incollare l'ingresso e l'uscita strato on cima molto, incapsulando l'intero gruppo.
   4. Rinforzare il legame con l'aggiunta di 1 kg di peso in cima e cottura a 100 ° C per 3 ore.
7. Prova di tenuta del dispositivo completato caricando acqua nello strato acquoso, poi immergendo l'intero dispositivo sotto acqua. Poi, il flusso d'aria attraverso lo strato di gas con una siringa vuota.
8. Sterilizzare dispositivi a prova di perdita con etanolo al 70% attraverso lo strato acquoso quindi lavare con tampone PBS, in cui il dispositivo viene conservata a 4 ° C fino all'utilizzo.

3. Setup microdispenser

1. Ottenere 2 microdispensers, 5 V e 20 V di alimentazione DC, e una scheda I / O digitale per costruire la miscelazione di ossigeno e la configurazione di consegna.
   1. Collegare i cavi di controllo delle microdispensers 'alle unità driver inclusi.
   2. Collegare i piloti di I / O digitali pensione porte corrispondenti ai controlli LabVIEW.
   3. Collegare gli alimentatori 5 V e 20 V corrispondenti contatti sul uni unitàts.
   4. Collegare l'I / O digitale a un computer portatile per eseguire codice LabVIEW per il controllo dei gas (allegato).
2. Collegare una microdispenser all'azoto mentre un'altra all'aria compressa, sia con 5% di CO _2. Impostare entrambi i gas a 2 psi. Collegare le uscite dei distributori "in un incrocio a T prima di entrare nel dispositivo microfluidica.
3. Utilizzando un dispositivo di tenuta collaudata, caratterizzare la risposta transitoria di modulazione ossigeno da ciclismo le microdispensers tra 5-21% di ossigeno, mentre la misurazione dell'ossigeno disciolto in acqua con un sensore a fibra ottica ossigeno (vedere inventario e risultati rappresentativi).

4. Impostazione al Microscopia

1. Montare il dispositivo alla fase riscaldata sul microscopio invertito.
2. Collegare 0% e 21% O ₂ gas al dispositivo e calibrare con il sensore di ossigeno.
3. Collegare la porta di uscita della microfluidica glucosio ad un collettore di frazioni.
4. Preparare il bicarbonato di Krebs Ringertampone (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO _3, 4.7 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1 mM CaCl ₂ · 2H ₂ O, 1,2 MgSO mm ₄ · 7H ₂ O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40 , 2 mM glucosio basale, e 5% FBS.
5. Preparare due soluzioni tampone contenente 2 mM e glucosio mm 14, rispettivamente, in 50 ml provette coniche bagnate da 37 ° C a bagnomaria.
6. Collegare una pompa peristaltica per disegnare tampone a 250 ml / min nel tubo. Scorrere il tubo su una piastra riscaldante a 37 ° C prima di entrare nel dispositivo microfluidica.
7. Per macchiare gli isolotti, aggiungere Fura-02:00 in DMSO e Rh123 in 100% etanolo per 2 ml di KRB per raggiungere concentrazioni di colorante finali di 5 micron e 2,5 micron, rispettivamente.
8. Raccogliere isolotti con una pipetta 10 microlitri e incubare in coloranti per 30 min a 37 ° C.
9. Caricare circa 20 isolotti nel dispositivo attraverso l'ingresso microcanali glucosio. Orientare gli isolotti nella camera di adescamento tampone dalla presa di nuovo in tha ingresso.
10. Profumato gli isolotti in un tampone per 10 minuti per lavare via coloranti in eccesso.

5. Esecuzione del ossigeno e glucosio stimolazione simultanea

1. Erogare un impulso di stimolazione con glucosio 5 min di base definita da KRB2, seguito da 15 min di stimolazione 14 mM, poi lavare per 15 minuti in KRB2.
2. Record 340/380 nm di eccitazione lunghezza d'onda per Fura-2 e 534 di emissione per Rh123.
3. Effettuare misure di un polso normale (normossiche 14 mm) prima di ogni esperimento.
4. Per la modulazione di ossigeno (ipossia / ipossia intermittente), si applicano solo il flusso del buffer durante la stimolazione e fasi di lavaggio e di assenza di flusso in altre fasi, per ridurre al minimo i disturbi convettivi.
5. Raccogliere effluenti da presa di glucosio a intervalli di 1 min per ELISA insulina.

Results

Al centro di questa tecnica isolotto ipossia è la capacità di modulare la stimolazione fase acquosa e gassosa nella stessa camera microfluidica con transienti minuto scala. Figura 1 è un risultato rappresentativo della a) doppi stimoli e b) modulazioni veloci misurati all'interno della camera isolotto. Modulazione acquosa, indicato dalla introduzione di fluoresceina nella camera, raggiunge l'equilibrio in tre o quattro minuti dalla miscelazione. Inoltre, l'ossigeno può essere un passo 5-21% con transien...

Discussion

Le molteplici modalità integrate in questa tecnica isolotto ipossia presenti diversi punti notati qui per la risoluzione dei problemi. In primo luogo le isolette isolate continuano a degradare e disintegrarsi nella cultura a causa di enzimi digestivi dalle cellule acinose. La standardizzazione esperimenti per 1-2 giorni dopo l'isolamento delle isole è quindi fondamentale per ottenere risultati coerenti. In secondo luogo, il flusso acquoso è stato fermato durante l'ipossia e ipossia intermittente per prevenire la...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
Piastra riscaldante digitale	PMC Dataplate	722A
Lampada di polimerizzazione UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Corona Wand	ETP	BD-20AC
Camera a vuoto	Bel-Art	420220000
Microdispenser	The Lee Company	IKTX0322000A
5 V e 20 V DC Power	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Termometro	Omega Engineering, Inc.
Pompa peristaltica	Gilson	Minipulse 2
Sensore di ossigeno	Ocean Optics	Collettore
	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ
Microscopio a epifluorescenza invertita	Leica	DMI 4000B
Provette coniche da 50 ml	Fisher Scientific
Fura-2 Sonde molecolari a colorante a fluorescenza	, Life Technologies
Rhodamine 123 Fluorescence Dye	Molecular Probes, Life Technologies Terreni
coltura	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glucosio	Sigma-Aldrich
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich
30 in tubi di silicone	Cole-Parmer		1/16 in x 1/8 in
1,5 ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific
Connettori a Y	Cole-Parmer		Connettori per siringa da 1/16 di pollice e 4 mm
	Cole-Parmer		da 1/16 poll.
		gomito
	Cole-Parmer		da 1/16 poll.