Controllo quantitativo e temporale di ossigeno Microenvironment al Islet Single Level

Summary

Controllo dell'ossigeno microfluidica conferisce più di una semplice comodità e velocità su camere ipossiche per esperimenti biologici. Soprattutto quando attuata tramite diffusione attraverso una membrana, ossigeno microfluidica può fornire liquido simultanea e modulazioni di fase gas a livello di microscala. Questa tecnica permette di esperimenti multi-parametriche dinamiche critica per lo studio isolotto fisiopatologia.

Abstract

Ossigenazione simultanea e monitoraggio di glucosio stimolo-secrezione di fattori di accoppiamento in una singola tecnica è fondamentale per la modellazione stati patofisiologici di isolotto ipossia, soprattutto in ambienti di trapianto. Tecniche camera ipossiche standard non possono modulare sia stimolazioni Allo stesso tempo, né fornire un monitoraggio in tempo reale dei fattori di accoppiamento stimolo-secrezione di glucosio. Per far fronte a queste difficoltà, abbiamo applicato una tecnica microfluidica multistrato di integrare sia acqueo e modulazioni in fase gas tramite una membrana di diffusione. Questo crea un panino stimolazione attorno agli isolotti microscaled all'interno del polidimetilsilossano trasparente periferica (PDMS), consentono il controllo dei suddetti fattori di accoppiamento tramite microscopia a fluorescenza. Inoltre, l'ingresso del gas è controllato da una coppia di microdispensers, fornendo quantitativi, modulazioni sub-minute di ossigeno tra 0-21%. Questo ipossia intermittente viene applicato a indagare su un nuovo fenomeno di isolat precondizionamento. Inoltre, armati di microscopio multimodale, siamo stati in grado di guardare il calcio dettagliate e dinamiche dei canali K _ATP durante questi eventi di ipossia. Noi immaginiamo ipossia microfluidica, in particolare questo simultanea tecnica a due fasi, come un valido strumento per studiare isole così come molti ex vivo tessuti.

Introduction

Ipossia dinamica è importante in biologia, in particolare per trapianti di isole

Ipossia dinamico è un importante fisiologica così come parametro fisiopatologico in molti tessuti biologici. Variazione ossigeno, per esempio, è un segnale di sviluppo potente nell'angiogenesi. Inoltre, i modelli spaziali e temporali in ipossia modulano HIF1-alfa e giocano un ruolo in malattie come il cancro del pancreas. L'ipossia è anche un fattore di confusione che interessano gli esiti del trapianto di isole pancreatiche. Recentemente, temporalmente oscillazioni di ipossia, o ipossia intermittente (IH) hanno dimostrato benefici in "precondizionamento....

Protocol

1. Preparare le isole di topo

1. Sezionare topi C57BL / 6 e isolare isolotti da digestione con collagenasi e separazione gradiente di densità Ficoll. (Fare riferimento ad articoli Giove riferimento in ^2,3).
2. Incubare isolotti in mezzo RPMI-1640 contenente 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, e 20 mM HEPES in piastre Petri (37 ° C, 5% CO _2). Post-isolamento, la cultura isolotti per 24 ore prima di utilizzare negli esperimenti. Utilizzare le isole entro 1-2 giorni per garantire risultati coerenti.

2. Rendere la piattaforma Microfluidic

1. Generare le geometrie microstruttura sulle ....

Results

Al centro di questa tecnica isolotto ipossia è la capacità di modulare la stimolazione fase acquosa e gassosa nella stessa camera microfluidica con transienti minuto scala. Figura 1 è un risultato rappresentativo della a) doppi stimoli e b) modulazioni veloci misurati all'interno della camera isolotto. Modulazione acquosa, indicato dalla introduzione di fluoresceina nella camera, raggiunge l'equilibrio in tre o quattro minuti dalla miscelazione. Inoltre, l'ossigeno può essere un passo 5-21% con transien.......

Discussion

Le molteplici modalità integrate in questa tecnica isolotto ipossia presenti diversi punti notati qui per la risoluzione dei problemi. In primo luogo le isolette isolate continuano a degradare e disintegrarsi nella cultura a causa di enzimi digestivi dalle cellule acinose. La standardizzazione esperimenti per 1-2 giorni dopo l'isolamento delle isole è quindi fondamentale per ottenere risultati coerenti. In secondo luogo, il flusso acquoso è stato fermato durante l'ipossia e ipossia intermittente per prevenire la.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150/SU8-2100
Piastra riscaldante digitale	PMC Dataplate	722A
Lampada di polimerizzazione UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Corona Wand	ETP	BD-20AC
Camera a vuoto	Bel-Art	420220000
Microdispenser	The Lee Company	IKTX0322000A
5 V e 20 V DC Power	Radio Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Termometro	Omega Engineering, Inc.
Pompa peristaltica	Gilson	Minipulse 2
Sensore di ossigeno	Ocean Optics	Collettore
	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ
Microscopio a epifluorescenza invertita	Leica	DMI 4000B
Provette coniche da 50 ml	Fisher Scientific
Fura-2 Sonde molecolari a colorante a fluorescenza	, Life Technologies
Rhodamine 123 Fluorescence Dye	Molecular Probes, Life Technologies Terreni
coltura	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
Glucosio	Sigma-Aldrich
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich
30 in tubi di silicone	Cole-Parmer		1/16 in x 1/8 in
1,5 ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific
Connettori a Y	Cole-Parmer		Connettori per siringa da 1/16 di pollice e 4 mm
	Cole-Parmer		da 1/16 poll.
		gomito
	Cole-Parmer		da 1/16 poll.