Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

Sommario

In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.

Abstract

Presentiamo un dispositivo microfluidico che consente la determinazione quantitativa di biomolecole intracellulari in più celle singole in parallelo. A questo scopo, le cellule sono passivamente intrappolati nel mezzo di una microcamera. All'attivazione del livello di controllo, la cella è isolato dal volume circostante in una piccola camera. Il volume circostante può quindi essere scambiati senza compromettere la cellula isolata. Tuttavia, dopo breve apertura e la chiusura della camera, la soluzione nella camera può essere sostituito entro poche centinaia di millisecondi. A causa della reversibilità delle camere, le cellule possono essere esposti a soluzioni diverse sequenzialmente in un modo altamente controllabile, ad esempio per incubazione, lavaggio, infine, lisi cellulare. I microchambers ermeticamente chiusi consentono il mantenimento del lisato, minimizzare e controllare la diluizione dopo lisi cellulare. Poiché lisi e analisi avvengono nello stesso luogo, l'alta sensibilità viene mantenuta perché senza ulteriori dilution o la perdita degli analiti avviene durante il trasporto. Il design microcamera consente pertanto l'analisi affidabile e riproducibile di piccolissimi numeri di copie di molecole intracellulari (attomoli, zeptomoles) rilasciate dalle cellule singole. Inoltre, molti microchambers possono essere organizzati in un formato matrice, consentendo l'analisi di molte celle contemporaneamente, dato che gli strumenti ottici adatti vengono utilizzati per il monitoraggio. Abbiamo già utilizzato la piattaforma per proof-of-concept studi per analizzare le proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori e secondi messaggeri in maniera quantificabile sia relativo o assoluto.

Introduzione

Molti studi in passato hanno rivelato cellula-cellula differenze all'interno di una vasta popolazione di cellule ^1-3, in particolare segnalazione elabora ⁴ o la quantità di biomolecole come proteine ​​intracellulari ^5,6, metaboliti e cofattori ^7,8. Queste eterogeneità sono considerati di fondamentale importanza per l'adattamento delle cellule e l'evoluzione ^9, ma anche svolgere un ruolo chiave nella nascita e nel trattamento di malattie come il cancro ^10-13. Pertanto, studi sul livello di singola cellula sono di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, soprattutto se questi studi rivelano le diverse risposte delle cellule dopo trattamento con sostanze chimiche bioattive.

Negli ultimi anni, molte piattaforme analitiche sono state sviluppate che facilitano l'analisi di cellule viventi singole o la composizione chimica del contenuto cellulare. Mentre fluorescente delle cellule attivate (FACS) è l'oro stAndard per analisi molto alto-capacità di singole cellule viventi, il metodo non può essere impiegato per la quantificazione di composti intracellulari o secrete. L'emergere di piattaforme microfluidica ha promesso nuove strategie analitiche per il posizionamento, il trattamento e l'osservazione delle singole cellule. Una pietra miliare nella microfluidica è stato raggiunto con l'integrazione di PDMS valvole flessibili realizzate da Quake e collaboratori ^14,15. Queste valvole sono utili poiché possono isolare regioni sul chip, ad esempio separare due culture ^16. Inoltre, sono particolarmente applicabile per l'analisi di singole cellule e quindi contribuire a ridurre i problemi di diluizione degli analiti. La potenza di questo approccio per l'analisi singola cellula è stato recentemente dimostrato da Hansen e colleghi, che hanno analizzato l'espressione genica da centinaia di singole cellule in parallelo ^17.

Quando il targeting proteine ​​e metaboliti, l'analisi è molto difficile a causa della mancanza di un adeguatometodi mplification, il gran numero di diversi composti presenti, e le loro variazioni di natura chimica. Inoltre, la maggior parte delle biomolecole intracellulari dovrebbero essere presenti in basso numero di copie nell'ordine di qualche decina di migliaia ^18, da cui il metodo analitico utilizzato deve avere una elevata sensibilità. Saggi più potenti come immunosaggi e immunoenzimatici (ELISA) sono difficili da integrare in dispositivi microfluidici quanto richiedono vari lavaggi e le fasi di incubazione e immobilizzazione superficie.

A causa di questi problemi, non è sorprendente che solo alcuni esempi sono stati riportati in cui le proteine ​​o metaboliti sono stati quantificati a livello di singola cellula. Per esempio, studi sulla secrezione di composti fluorescenti sono stati segnalati ^19,20. Recentemente, l'implementazione con ELISA è stata presentata per l'analisi di secrete (non fluorescente) proteine ​​da una coltura cellulare (cellule THP-1) ²¹ e singolo (immune) cellule ^10. Targeting proteine ​​intracellulari, Shi et al. Sviluppato un dispositivo microfluidico che ha facilitato l'identificazione di proteine ​​intracellulari per l'analisi delle vie di segnalazione nelle cellule tumorali mediante un immunodosaggio ^11. Tuttavia, solo quantità relative di proteine ​​sono stati determinati e nessuna amplificazione enzimatica è stato utilizzato per aumentare il segnale per le proteine ​​a bassa abbondanza.

Recentemente, siamo stati in grado di combinare una cella singola cattura Microdevice con saggi di fluorescenza ⁸ e immunoassays ²² (Figura 1). Le cellule sono passivamente intrappolati in strutture ostacolo microsized, che permettono di alimentazione e (rapido) scambio di medie e di altri agenti chimici senza alcun movimento delle cellule. Una valvola ad anello attorno a ciascuna trappola consente l'isolamento della cella in un volume molto piccolo ("microcamera"). Questa valvola viene attivata subito dopo aver introdotto una cella-lisi (hypoosmolar) tampone, eglince prevenire molecole intracellulari o molecole secrete a diffondere via. Ancora più importante, a causa delle ridotte dimensioni del volume (625 pl) è evitata grande diluizione delle molecole. Inoltre, poiché lisi e analisi vengono eseguite nella stessa posizione nel chip, non vi è alcuna perdita di analiti dovuti al trasporto. La progettazione di chip qui descritto comprende 8 righe alterne di 7 o 8 microchambers, per un totale di 60 microchambers. Le camere sono azionati in file, in modo che la contaminazione incrociata lungo una linea è preclusa.

La piattaforma può essere utilizzata in combinazione con saggi di fluorescenza e test immunologici (Figura 1D). Per questi ultimi, abbiamo stabilito protocolli per l'immobilizzazione degli anticorpi, che sono compatibili con la produzione di chip e processo di assemblaggio. Quindi la piattaforma apre la strada a test sensibile, affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l'analisi di ienzimi ntracellular e secrete (quantificazione relativa da saggi enzimatici), cofattori intracellulari, proteine ​​e piccole molecole (quantificazione assoluta mediante saggi endpoint o ELISA). Nel seguito si descrive il processo di fabbricazione di chip mediante multistrato litografia morbida e protocolli per patterning degli anticorpi tramite stampa microcontact e chimica di superficie. Inoltre, alcuni esempi di utilizzo del chip e le operazioni sono dati.

Protocollo

1. SU-8 master Fabrication

Preparare entrambe stampi principali per i canali (fluidici e di controllo, per schemi e dimensioni vedere Figura 2) con il seguente protocollo ma con differenti modelli di maschera. Il processo è mostrato nella figura 3a.

1. Inizia riscaldando un wafer di silicio da 4 pollici per 10 min a 180 ° C. Caricare il wafer disidratato in uno spin-torre di verniciatura e utilizzare il seguente protocollo per spin-coating SU-8 2015:
   1. Spin wafer a 100 rpm per 20 sec (coperchio aperto di spin-coater, dispensare SU-8 durante questa fase, chiudere il coperchio dopo la dispensazione).
   2. Spin wafer a 500 rpm per 10 sec (estenderebbe l'resistere sull'intero wafer).
   3. Spin wafer a 1.750 rpm per 30 sec (definisce l'altezza del resist a 20 micron).
2. Rimuovere resistere dal bordo del wafer con acetone (utilizzare un tampone) poiché ciò altrimenti aderire alla piastra nella fase successiva. Trasferire il wafer ahotplate a 95 ° C e calore per 4 min. Dopo la softbake, esporre il resist attraverso un fotomaschera attaccata al vetro sodalime in un allineatore maschera con luce UV (150 mJ / cm ^2, misurata a 365 nm).
3. Dopo l'esposizione, riscaldare il wafer di nuovo a 95 ° C per 5 min su una piastra. Raffreddare il wafer di RT e poi immergerlo in un bagno di SU-8 sviluppatore per 4 min. Agitare delicatamente per rimuovere impressionate SU-8. Lavare il wafer con clean-room grado isopropanolo e asciugare con azoto. Controllare al microscopio se lo sviluppo ha avuto successo (soprattutto le trappole cellulari). Se le trappole cellulari sono completamente sviluppati, il riflesso del wafer di silicio dovrebbe essere visibile. Se necessario, sviluppare nuovamente il wafer per alcuni minuti.
4. Cuocere il wafer in stufa per 2 ore a 180 ° C per rimuovere tutto il solvente residuo. Controllare l'altezza dei canali con un profiler passo. Se l'altezza differisce dalla altezza desiderata, ripetere questo protocollo partendo dal punto 1.1 con una nuova wafer ecambiare lo spin-velocità (fase 1.1.3). Finalizzare la fabbricazione di stampo master silanizzante la cialda con 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silano in un essiccatore durante la notte.

2. Fabrication Master stampa microcontact

1. Per preparare maestri stampi per la stampa microcontact, disidratare un wafer di silicio per 10 min a 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS su questo wafer a 7.500 rpm per 30 sec (resist aderisce meglio alla superficie silanizzata). Spin-cappotto 2 ml di AZ1518 positivo resistono con questo protocollo:
   1. Erogazione statica del resist al wafer.
   2. Spin wafer per 5 secondi a 500 giri al minuto.
   3. Spin wafer per 60 sec a 4000 giri.
2. Dopo un secondo softbake 50 a 100 ° C su una piastra, esporre il resist di luce UV (21 mJ / cm ² a 365 nm) attraverso una fotomaschera ed un allineatore maschera. Sviluppare il resist in un bagno di AZ 726 per 75 sec. Sciacquare il wafer sviluppato con acqua demineralizzata e colpo dry con azoto. Rimuovere il solvente residuo riscaldando il wafer a 115 ° C per 50 sec. Silanizzazione wafer sottovuoto durante la notte.

3. Realizzazione della Microfluidic Chip

Un disegno dispositivo a due strati viene utilizzato per questi esperimenti. I due strati sono preparati separatamente e sono legati insieme, prima che il chip viene finalmente incollato su un vetrino (Figura 3b). Questo passaggio descrive la produzione dei PDMS strati e il timbro PDMS per la stampa microcontact.

1. Preparare una miscela di PDMS 10:01 e agente indurente. Preparare circa 80 g di PDMS in totale (usando le nostre idee, questo si tradurrà in 10 gettoni). Mescolare le due parti vigorosamente e degassarla PDMS finché il composto è bolla libera (~ 30 min).
2. Posizionare il wafer con lo strato di controllo all'interno di una capsula di Petri e nastro sul fondo. Successivamente, versare ~ 50 g di PDMS sulla parte superiore e mettere il wafer per almeno 2 ore in un forno a 80 ° C per assicurare la completaindurimento delle PDMS. Ripetere la stessa procedura per il wafer stampa microcontact, per questo è necessario ~ 20 g PDMS.
3. Spin-coat PDMS sul wafer con lo strato fluidico ad una velocità di rotazione di 2.000 rpm per formare uno strato di circa 40 micron alta PDMS. Curare le PDMS in un forno per almeno 1 ora a 80 ° C.
4. Quando entrambe le parti sono guariti, rimuovere lo strato di controllo dal wafer e tagliato a pezzi con una lama di rasoio. Perforare connessione pressione utilizzando una biopsia perforatore ad 1 mm. Per lo stoccaggio, si consiglia di mettere un pezzo di nastro sui canali.
5. Per legare i due strati, prendere l'ostia spin-rivestito e la parte superiore e metterli in un pulitore del plasma ^23. Dopo il trattamento al plasma, allineare rapidamente entrambe le parti sotto un microscopio con grande distanza di lavoro. Aggiungere alcuni pezzi di PDMS intorno alle parti superiori collocati. Questo passaggio non è obbligatorio, tuttavia facilita la rimozione dei PDMS dal wafer. Posizionare il wafer in un forno a 80 ° C per almeno 1 ora.
6. Utilizzare un bisturi per rimuovere con attenzione le PDMS dal wafer e tagliare i microchip. Punch fori di accesso per i collegamenti fluidici con biopsia perforatore 1,5 millimetri.
7. Il chip PDMS è terminata e può essere conservato per mesi. Facoltativo: Se il chip è utilizzato con un serbatoio, tagliare la parte superiore di una punta di pipetta 200 microlitri e utilizzare alcune ricambio, PDMS semi-indurito per incollarla sopra. Mettere il chip in forno nuovamente a 80 ° C per almeno 1 ora.

4. Bonding per vetrino

Per utilizzare il dispositivo per saggi enzimatici diretti, l'unico passo necessario dopo l'incollaggio è il blocco di superfici. Per questo protocollo, procedere ad A. Tuttavia, per utilizzare il chip microfluidica per test immunologici o ELISA, si prega di fare riferimento al protocollo B per limitare i siti di legame solo al vetrino (vale a dire per la microscopia TIRF o SPR). Se questa limitazione non è importante, fare riferimento ad A, ma utilizzare coniugati biotinilato in fase 4.3 e continuare con la fase 4.8nel protocollo B per creare una superficie completamente funzionale.

Prima di eseguire protocollo A e B: Si consiglia di filtrare tutte le soluzioni proteiche utilizzato prima di introdurli nel chip. Detriti e aggregati proteici possono altrimenti bloccare trappole cellulari, riducendo così il numero di camere che possono essere utilizzati per l'analisi. A questo scopo, utilizzare un nonprotein unità filtro assorbente per filtrare tutte le soluzioni prima di introdurli nei canali.

Protocollo A (saggi enzimatici)

1. Per finalizzare il dispositivo microfluidica, legare le parti PDMS su un vetrino. Per fare questo, prima pulire un vetrino con sapone, acqua distillata ed etanolo. Essiccare vetrino utilizzando un flusso di azoto. Pulire la parte PDMS con lo scotch.
2. Mettere la parte PDMS e il vetrino pulito nel pulitore plasma per 45 sec a 18 W. Per garantire un legame stretto, mettere il chip su una piastra calda (100 ° C) per 5 min.
3. Dopo l'incollaggio, riempire il chip con fLUID. Un modo semplice per raggiungere questo obiettivo è quello di utilizzare la forza centrifuga. Tagliare la parte inferiore della punta di 200 microlitri pipetta. Per i canali fluidici, riempirli con la soluzione di saturazione (albumina di siero bovino (4% w / v) o poli-L-lisina) glicole polietilene innestato (0.05% w / v) e posizionare le punte nelle prese. Riempire le insenature livello di controllo con acqua o con una soluzione isosmotic, ad esempio PBS. Posizionare il chip nella centrifuga (800 xg) per 5 min. I canali dovrebbero essere ora pieni di liquido completamente. In caso contrario, ripetere questo passaggio.
4. Incubare la soluzione di saturazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare la soluzione di strato di fluido con PBS ad una portata di 10 microlitri / min utilizzando una pompa a siringa. Il dispositivo è ora pronto per esperimenti sulle cellule.

Protocollo B (i dosaggi)

Per una panoramica completa della modifica della superficie dal punto 4.7 in poi, si prega di fare riferimento alla Tabella 1.

5. InPDMS cubate Stamp per la stampa microcontact con una soluzione bBSA / BSA (es 1-100). Dopo 30 min, pulire i francobolli accuratamente con acqua distillata e asciugare il timbro in corrente di azoto. Introdurre rapidamente i francobolli su un vetrino pulito (Figura 4).
6. Esporre il vetrino con il timbro insieme alla parte superiore del chip microfluidica di plasma di ossigeno per 45 sec a potenza massima (18 W) e un detersivo plasma. Dopo il trattamento al plasma, rimuovere il timbro e allineare la superficie stampata sotto le microchambers del dispositivo. Posizionare il chip per 30 min su una piastra calda a 50 ° C.
7. Per bloccare la rimanente superficie, introdurre soluzione filtrata sterile BSA (4% (w / v) in PBS) nel chip con una centrifuga (vedi fase 4.2). Incubare per 1 ora e lavare la soluzione fuori dello strato di fluido con PBS (vedi passo 4.3). Il chip può essere utilizzato direttamente o conservata fino a 2 settimane a 4 ° C in un contenitore umido.
8. Per un tensioattivo vincolante completamente funzionalee, introdurre avidina (0,025% (w / v) in PBS) nel serbatoio. Utilizzare un flusso di 5 ml / min per 30 min a ritirare la soluzione avidina attraverso i canali del fluido. Successivamente, lavare PBS per 10 min. Sciacquare accuratamente il serbatoio.
9. Successivamente, aggiungere proteine ​​G (0,0025% (w / v) in PBS) e filo per altri 30 min. Lavare con PBS per altri 10 min dopo. Successivamente, aggiungere l'anticorpo di interesse (0,0001% (w / v) in PBS) per 10 min. Dopo 10 minuti, fermare il flusso per 15 minuti per consentire il legame. Successivamente, lavare con PBS per 10 min.

5. Esperimenti cellulari

Il protocollo è scritto in termini generali, a causa della varietà di possibili saggi. Come esempio i reagenti necessari per il saggio di tossicità G6PDH sono dati. La cella cattura efficienza iniziale del dispositivo è di circa 2,5%, vale a dire 5 di 200 cellule saranno intrappolati. L'occupazione finale delle trappole cellula dipende fortemente dalla linea cellulare utilizzata, il protocollo di sospenderela linea cellulare e il tempo le cellule sono irrigati attraverso il canale. Per le cellule naturalmente crescono in sospensione (ad esempio U937), singole cellule possono essere trovati in circa il 75% delle camere dopo pochi minuti. Le altre camere non sono o pieni, o occupati da due o più celle. In generale, l'occupazione cella singola è minore per linee cellulari aderenti. Quando si utilizza il protocollo di sospensione piuttosto mite qui presentato, la percentuale diminuisce a circa il 30% (HEK, cellule MLT). L'occupazione singola cellula può essere migliorata mediante trattamento con tripsina delle cellule, ma puo anche alterare i risultati degli esperimenti.

A seconda della molecola bersaglio, adsorbimento o assorbimento di PDMS possono influenzare i risultati. Adsorbimento può essere ridotta bloccando le superfici con BSA o PLL-g-PEG. L'assorbimento è improbabile che la maggior parte delle biomolecole idrofile, ma dovrebbe essere controllato per (piccoli) componenti cellulari lipofile.

1. Preparare le cellule secondo il protocollo specifico (ad esempio tossicodipendenza). Per cellule in sospensione, aggiungere celle direttamente al chip. Per linee cellulari adesive, utilizzare tampone dissociazione senza enzima per produrre una sospensione cellulare. Filtrare le cellule prima di introdurle al chip per ridurre la quantità di gruppi di cellule.
2. Caricare le cellule sul chip mediante una pompa a siringa e portata avanti, piuttosto che di ritirare la sospensione cellulare. Utilizzare un flusso di 5 ml / min per linee cellulari sospensione e portate maggiori di 10-20 ml / min per le cellule adesive da ridurre attaccamento aspecifica delle cellule sulle pareti del canale.
3. Quando le trappole sono pieni, chiudere le camere. Se molte cellule aderiscono non specifico alla superficie, cercare di lavarli via con tampone di dissociazione cellulare ad una portata di 10-30 ml / min.

Protocollo A (saggi enzimatici)

4. Prelevare tampone di lisi attraverso il chip. Per questo esempio, questo buffer è un buffer hypoosmolar con aggiunta di Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl _2, 1% (v / v) di Tween 20). Per lisi, camere rapidamente aprire e chiudere (cioè 500 msec per portate di 10-50 ml / min ^7,21). Per il saggio G6PDH, aggiungere 2 mM di glucosio-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml diaforasi e 0,3 mM resazurin al tampone di lisi. Avviare il monitoraggio della cinetica di reazione subito dopo la lisi.

Nota: Scegliere una tampone che è adatto per il test, ma nudo in mente che detergenti aggressivi (come Triton, SDS), le cellule Lisare immediatamente e porterà ad una perdita di analita durante l'apertura della camera.

Protocollo B (i dosaggi)

Per una breve descrizione degli esperimenti ELISA cellulari (le portate, stato da camera, ecc), si prega di fare riferimento alla Tabella 1.

5. Per ELISA, aggiungere il reagente di rilevamento richiesto (es anticorpo secondario, antigene marcato) direttamente al tampone di lisi. Il presente documento ha aggiunto Tween 20 riduce l'adsorbimento non specifico. Lisare le celle in base al punto 5.4. Incubare la miscela per 10-15 minuti per consentire la rilegatura (tempo di incubazione a seconda dell'antigene utilizzato e anticorpo).
6. Coniugati anticorpo enzimatico che adsorbiti aspecifico alle pareti del canale possono portare ad una conversione del reagente di rilevamento già all'interno del serbatoio e canali. Per ridurre i problemi di questa adsorbimento, lavare un inibitore permanente dell'enzima rilevamento utilizzato attraverso il chip durante il tempo di incubazione (camere chiuse, prima di aggiungere il reagente di rilevamento). Per HRP, usare HCl 20 mM in acqua per inattivare gli enzimi aspecifico definitivamente assorbiti.
7. Dopo il tempo di incubazione, introdurre il reagente di rilevamento (es Amplex rosso e perossido di idrogeno per HRP) al chip. Aprire le camere di nuovo brevemente per lavare l'anticorpo secondario nonbound distanza e aggiungere il reagente di rilevamento. Avviare il monitoraggio della reazione cinetica immediatamente.
8. Calibrazione: Immobilizzarel'anticorpo contro il bersaglio di interesse. Chiudere camere. Preparare diverse concentrazioni di analita in tampone o in lisato cellulare off-chip. Applicare una concentrazione al chip e scambiare rapidamente il volume all'interno delle camere (500 msec tempo di apertura). Questo tempo di apertura è sufficientemente breve per evitare un ulteriore accumulo si verifica da analita lavaggio, e solo un numero specifico di molecole dal volume della microcamera vengono rilevati. Dal noto concentrazione dell'antigene all'interno della soluzione e il volume della camera (625 pl), calcolare la quantità all'interno della camera. Successivamente, continuare con il passo 5.5 e introdurre la parte di rivelazione.

Risultati

La nostra piattaforma è in grado di analizzare una varietà di intracellulare nonché molecole secrete o produce da singole cellule. Ecco, vorremmo presentare diversi studi di esempio per sottolineare la varietà di possibili saggi. Daremo un esempio di un enzima secreto (Figura 5a), così come un enzima intracellulare (Figura 5b) e proteine ​​(figure 5c e d). Per altri esempi, come cofattori o piccole molecole, consultare Eyer et al. (2012) e Eyer...

Discussione

La tecnologia microfluidica ha aperto nuove e affascinanti possibilità per l'analisi singola cellula. In particolare, la possibilità di intrappolare e immobilizzare le cellule singolarmente dagli strumenti di microfluidica ha permesso studi sistematici a breve e lungo termine sulle proprietà monocellulari e la risposta. Inoltre, incapsulamento di cellule in microgocce alta frequenza, generati su un microchip, ha consentito studi di secrezione di cellule singole, che non possono essere eseguite con dispositivi citome...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTS:
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)
	ABCR (Karlsruhe, Germania)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetilchitobioside idrato	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (Darmstadt, Germania)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germania)	n.a.AZ
726 sviluppatore	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germania)	n.a.
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	A-4503
Albumina sierica bovina, biotina	Sigma Aldrich	A-8549
Tampone di dissociazione cellulare	Invitrogen	13151-014
Esametiltililazano (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Acido cloridrico	Fluka	84422
Isopropanolo	Merck VWR (Darmstadt, Germania)	109634
Cloruro di magnesio esaidrato	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlino, Germania)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG innestato	SuSoS, (Dü bendorf, Svizzera)	n.a.PLL-g-PEG
biotina innestata	SuSoS, (Dü bendorf, Svizzera)	n.a.Cloruro
potassio	Fluka	60132
Proteina G, biotina	Sigma Fine Chemicals	41624
Wafer di silicio	Si-Mat (Kaufering, Germania)	n.a.Sylgard
184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(idrossimetil)-amminomethan	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
ATTREZZATURA:
Materiale Nome	Azienda	Numero	di catalogo Commenti (opzionale)
0.22 &; m Filtro per siringa in PES	TRP	99722
Perforatore per biopsia da 1/1,5 mm	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Filtro Trics cellulare 20 &; m	Partec	04-004-2325
Centrifuga Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Piastra
riscaldante HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Svizzera	n.a.MA-6
allineatore maschera	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M microscopio	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Pulitore al plasma PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Moduli
di centrifuga SM 180 BM	Sawatec, Sax, Svizzera	n.d.Step
profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Pompa
a siringa neMESYS	Cetoni	n.a.