Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

Summary

In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.

Abstract

Presentiamo un dispositivo microfluidico che consente la determinazione quantitativa di biomolecole intracellulari in più celle singole in parallelo. A questo scopo, le cellule sono passivamente intrappolati nel mezzo di una microcamera. All'attivazione del livello di controllo, la cella è isolato dal volume circostante in una piccola camera. Il volume circostante può quindi essere scambiati senza compromettere la cellula isolata. Tuttavia, dopo breve apertura e la chiusura della camera, la soluzione nella camera può essere sostituito entro poche centinaia di millisecondi. A causa della reversibilità delle camere, le cellule possono essere esposti a soluzioni diverse sequenzialmente in un modo altamente controllabile, ad esempio per incubazione, lavaggio, infine, lisi cellulare. I microchambers ermeticamente chiusi consentono il mantenimento del lisato, minimizzare e controllare la diluizione dopo lisi cellulare. Poiché lisi e analisi avvengono nello stesso luogo, l'alta sensibilità viene mantenuta perché senza ulteriori dilution o la perdita degli analiti avviene durante il trasporto. Il design microcamera consente pertanto l'analisi affidabile e riproducibile di piccolissimi numeri di copie di molecole intracellulari (attomoli, zeptomoles) rilasciate dalle cellule singole. Inoltre, molti microchambers possono essere organizzati in un formato matrice, consentendo l'analisi di molte celle contemporaneamente, dato che gli strumenti ottici adatti vengono utilizzati per il monitoraggio. Abbiamo già utilizzato la piattaforma per proof-of-concept studi per analizzare le proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori e secondi messaggeri in maniera quantificabile sia relativo o assoluto.

Introduction

Molti studi in passato hanno rivelato cellula-cellula differenze all'interno di una vasta popolazione di cellule ^1-3, in particolare segnalazione elabora ⁴ o la quantità di biomolecole come proteine ​​intracellulari ^5,6, metaboliti e cofattori ^7,8. Queste eterogeneità sono considerati di fondamentale importanza per l'adattamento delle cellule e l'evoluzione ^9, ma anche svolgere un ruolo chiave nella nascita e nel trattamento di malattie come il cancro ^10-13. Pertanto, studi sul livello di singola cellula sono di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, soprattutto se questi....

Protocol

1. SU-8 master Fabrication

Preparare entrambe stampi principali per i canali (fluidici e di controllo, per schemi e dimensioni vedere Figura 2) con il seguente protocollo ma con differenti modelli di maschera. Il processo è mostrato nella figura 3a.

1. Inizia riscaldando un wafer di silicio da 4 pollici per 10 min a 180 ° C. Caricare il wafer disidratato in uno spin-torre di verniciatura e utilizzare il seguente protocollo per spin-coating SU-8 2015:
   1. Spin wafer a 100 rpm per 20 sec (coperchio aperto di spin-coater, dispensare SU-8 durante questa fase, chiudere il coperchio dopo la dispensazi....

Results

La nostra piattaforma è in grado di analizzare una varietà di intracellulare nonché molecole secrete o produce da singole cellule. Ecco, vorremmo presentare diversi studi di esempio per sottolineare la varietà di possibili saggi. Daremo un esempio di un enzima secreto (Figura 5a), così come un enzima intracellulare (Figura 5b) e proteine ​​(figure 5c e d). Per altri esempi, come cofattori o piccole molecole, consultare Eyer et al. (2012) e Eyer.......

Discussion

La tecnologia microfluidica ha aperto nuove e affascinanti possibilità per l'analisi singola cellula. In particolare, la possibilità di intrappolare e immobilizzare le cellule singolarmente dagli strumenti di microfluidica ha permesso studi sistematici a breve e lungo termine sulle proprietà monocellulari e la risposta. Inoltre, incapsulamento di cellule in microgocce alta frequenza, generati su un microchip, ha consentito studi di secrezione di cellule singole, che non possono essere eseguite con dispositivi citome.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS:
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)
	ABCR (Karlsruhe, Germania)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetilchitobioside idrato	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (Darmstadt, Germania)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germania)	n.a.AZ
726 sviluppatore	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germania)	n.a.
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	A-4503
Albumina sierica bovina, biotina	Sigma Aldrich	A-8549
Tampone di dissociazione cellulare	Invitrogen	13151-014
Esametiltililazano (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Acido cloridrico	Fluka	84422
Isopropanolo	Merck VWR (Darmstadt, Germania)	109634
Cloruro di magnesio esaidrato	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlino, Germania)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG innestato	SuSoS, (Dü bendorf, Svizzera)	n.a.PLL-g-PEG
biotina innestata	SuSoS, (Dü bendorf, Svizzera)	n.a.Cloruro
potassio	Fluka	60132
Proteina G, biotina	Sigma Fine Chemicals	41624
Wafer di silicio	Si-Mat (Kaufering, Germania)	n.a.Sylgard
184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(idrossimetil)-amminomethan	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
ATTREZZATURA:
Materiale Nome	Azienda	Numero	di catalogo Commenti (opzionale)
0.22 &; m Filtro per siringa in PES	TRP	99722
Perforatore per biopsia da 1/1,5 mm	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Filtro Trics cellulare 20 &; m	Partec	04-004-2325
Centrifuga Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Piastra
riscaldante HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Svizzera	n.a.MA-6
allineatore maschera	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M microscopio	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Pulitore al plasma PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Moduli
di centrifuga SM 180 BM	Sawatec, Sax, Svizzera	n.d.Step
profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Pompa
a siringa neMESYS	Cetoni	n.a.