In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.
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Articolo metodologico
Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule
In questo articolo
Sommario
Abstract
Presentiamo un dispositivo microfluidico che consente la determinazione quantitativa di biomolecole intracellulari in più celle singole in parallelo. A questo scopo, le cellule sono passivamente intrappolati nel mezzo di una microcamera. All'attivazione del livello di controllo, la cella è isolato dal volume circostante in una piccola camera. Il volume circostante può quindi essere scambiati senza compromettere la cellula isolata. Tuttavia, dopo breve apertura e la chiusura della camera, la soluzione nella camera può essere sostituito entro poche centinaia di millisecondi. A causa della reversibilità delle camere, le cellule possono essere esposti a soluzioni diverse sequenzialmente in un modo altamente controllabile, ad esempio per incubazione, lavaggio, infine, lisi cellulare. I microchambers ermeticamente chiusi consentono il mantenimento del lisato, minimizzare e controllare la diluizione dopo lisi cellulare. Poiché lisi e analisi avvengono nello stesso luogo, l'alta sensibilità viene mantenuta perché senza ulteriori dilution o la perdita degli analiti avviene durante il trasporto. Il design microcamera consente pertanto l'analisi affidabile e riproducibile di piccolissimi numeri di copie di molecole intracellulari (attomoli, zeptomoles) rilasciate dalle cellule singole. Inoltre, molti microchambers possono essere organizzati in un formato matrice, consentendo l'analisi di molte celle contemporaneamente, dato che gli strumenti ottici adatti vengono utilizzati per il monitoraggio. Abbiamo già utilizzato la piattaforma per proof-of-concept studi per analizzare le proteine intracellulari, enzimi, cofattori e secondi messaggeri in maniera quantificabile sia relativo o assoluto.
Introduzione
Molti studi in passato hanno rivelato cellula-cellula differenze all'interno di una vasta popolazione di cellule 1-3, in particolare segnalazione elabora 4 o la quantità di biomolecole come proteine intracellulari 5,6, metaboliti e cofattori 7,8. Queste eterogeneità sono considerati di fondamentale importanza per l'adattamento delle cellule e l'evoluzione 9, ma anche svolgere un ruolo chiave nella nascita e nel trattamento di malattie come il cancro 10-13. Pertanto, studi sul livello di singola cellula sono di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, soprattutto se questi....
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Protocollo
1. SU-8 master Fabrication
Preparare entrambe stampi principali per i canali (fluidici e di controllo, per schemi e dimensioni vedere Figura 2) con il seguente protocollo ma con differenti modelli di maschera. Il processo è mostrato nella figura 3a.
- Inizia riscaldando un wafer di silicio da 4 pollici per 10 min a 180 ° C. Caricare il wafer disidratato in uno spin-torre di verniciatura e utilizzare il seguente protocollo per spin-coating SU-8 2015:
- Spin wafer a 100 rpm per 20 sec (coperchio aperto di spin-coater, dispensare SU-8 durante questa fase, chiudere il coperchio dopo la dispensazi....
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Risultati
La nostra piattaforma è in grado di analizzare una varietà di intracellulare nonché molecole secrete o produce da singole cellule. Ecco, vorremmo presentare diversi studi di esempio per sottolineare la varietà di possibili saggi. Daremo un esempio di un enzima secreto (Figura 5a), così come un enzima intracellulare (Figura 5b) e proteine (figure 5c e d). Per altri esempi, come cofattori o piccole molecole, consultare Eyer et al. (2012) e Eyer.......
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Discussione
La tecnologia microfluidica ha aperto nuove e affascinanti possibilità per l'analisi singola cellula. In particolare, la possibilità di intrappolare e immobilizzare le cellule singolarmente dagli strumenti di microfluidica ha permesso studi sistematici a breve e lungo termine sulle proprietà monocellulari e la risposta. Inoltre, incapsulamento di cellule in microgocce alta frequenza, generati su un microchip, ha consentito studi di secrezione di cellule singole, che non possono essere eseguite con dispositivi citome.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Tom Robinson per la lettura delle bozze del manoscritto, C. Bärtschi e H. Benz per la realizzazione del sistema di controllo della pressione custom-built. Vorremmo inoltre ringraziare l'uso della funzione stanza pulita prima e la microscopia ottica Center (LMC), sia presso l'ETH di Zurigo. Il lavoro è stato finanziato dalla Merck Serono e dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del 7 ° Programma Quadro (ERC Starting Grant, progetto n. 203.428, nμLIPIDs).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS: | |||
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | ||
| ABCR (Karlsruhe, Germania) | AB103608 | ||
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetilchitobioside idrato | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germania) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germania) | n.a.AZ | |
| 726 sviluppatore | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germania) | n.a. | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Albumina sierica bovina, biotina | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Tampone di dissociazione cellulare | Invitrogen | 13151-014 | |
| Esametiltililazano (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Acido cloridrico | Fluka | 84422 | |
| Isopropanolo | Merck VWR (Darmstadt, Germania) | 109634 | |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlino, Germania) | n.a.PBS | |
| Invitrogen | 10010-031 | ||
| PLL-g-PEG innestato | SuSoS, (Dü bendorf, Svizzera) | n.a.PLL-g-PEG | |
| biotina innestata | SuSoS, (Dü bendorf, Svizzera) | n.a.Cloruro | |
| potassio | Fluka | 60132 | |
| Proteina G, biotina | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Wafer di silicio | Si-Mat (Kaufering, Germania) | n.a.Sylgard | |
| 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(idrossimetil)-amminomethan | Biorad | ||
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| ATTREZZATURA: | |||
| Materiale Nome | Azienda | Numero | di catalogo Commenti (opzionale) |
| 0.22 &; m Filtro per siringa in PES | TRP | 99722 | |
| Perforatore per biopsia da 1/1,5 mm | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Filtro Trics cellulare 20 &; m | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuga Sigma 3-18K | Kuehner | n.a.Piastra | |
| riscaldante HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Svizzera | n.a.MA-6 | |
| allineatore maschera | Karl Suess | n.a.Multizoom | |
| AZ100M microscopio | Nikon Corporation | n.a.Photomask | |
| Microlitho, Essex, U.K. | n.a | ||
| Pulitore al plasma PDC-32G | Harrick | n.a.Spin | |
| coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a.Moduli | |
| di centrifuga SM 180 BM | Sawatec, Sax, Svizzera | n.d.Step | |
| profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a.Pompa | |
| a siringa neMESYS | Cetoni | n.a. |
Riferimenti
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V....
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Ristampe e permessi
