L'attuale articolo descrive un protocollo per stabilire un sistema cellulare modello di coltura in vitro per studiare l'interazione di una facoltativo intracellulare patogeno fungino umano Candida glabrata con i macrofagi umani che saranno un utile strumento per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi di virulenza fungine.
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Articolo metodologico
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Un sistema cellulare modello di coltura, se un vicino mimo di condizioni ambientali ospitanti, può servire come un'alternativa economica, riproducibile e facilmente manipolabile per sistemi modello animale per lo studio di una fase specifica di infezione microbica patogeno. Una linea cellulare monocitica umana THP-1 che, al momento phorbol trattamento estere, è differenziato in macrofagi, è già stata utilizzata per studiare le strategie di virulenza di molti patogeni intracellulari, tra cui Mycobacterium tuberculosis. Qui, discutiamo un protocollo di emanare una cellula in vitro modello di cultura sistema che utilizza THP-1 macrofagi per delineare l'interazione di un opportunista lievito Candida glabrata agente patogeno umano con fagociti host. Questo sistema modello è semplice, veloce, suscettibili di schermi mutanti high-throughput, e non richiede attrezzature sofisticate. Un tipico esperimento THP-1 infezione dei macrofagi richiede circa 24 ore con un ulteriore 24-48 ore per permettere intracellulare recuperatolievito di crescere su terreno ricco di formanti colonia analisi fattibilità basato su unità. Come altri sistemi modello in vitro, un possibile limite di questo approccio è la difficoltà di estrapolare i risultati ottenuti da una circuiteria cellule immunitarie altamente complesso esistente nell'ospite umano. Tuttavia, nonostante questo, l'attuale protocollo è molto utile per chiarire le strategie che un patogeno fungino può utilizzare per eludere / contrastare risposta antimicrobica e sopravvivere, adattarsi e proliferare in un ambiente povero di nutrienti delle cellule immunitarie dell'ospite.
Introduzione
Specie di Candida sono la principale causa di infezioni fungine invasive potenzialmente letali nei pazienti immunocompromessi 1. Candida glabrata, un patogeno nosocomiale emergente, è il secondo o il terzo più frequentemente isolati specie di Candida da pazienti nell'unità di terapia intensiva a seconda della posizione geografica 1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, un lievito in erba aploidi, è più strettamente legato alle Saccharomyces non lievito modello patogeno cerevisiae che a patogeni Candida spp. tra cui C. albicans 4. Coerentemente con questo, C. glabrata manc....
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Protocollo
Si consiglia di eseguire C. glabrata esperimenti di infezione in un laboratorio con livello di biosicurezza di contenimento 2 (BSL-2).
- Preparazione di THP-1 macrofago monostrato.
- Preparazione di C. sospensione cellulare glabrata.
- Infezione di cellule THP-1 macrofagi con C. cellule glabrata.
- Misurazione della frequenza fagocitosi e replicazione intracellulare tramite unità formanti colonie saggio.
- Monitoraggio della replica intracellulare mediante microscopio confocale a scansione laser.
1. Preparazione di THP-1 macrofagi Monolayer
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Risultati
Infezione analisi di PMA trattati THP-1 macrofagi con C. tipo selvatico glabrata (wt), le cellule hanno rivelato che le cellule wt stati fagocitati dai macrofagi ad un tasso del 55-65% dopo 2 ore coincubation. Inoltre, C. glabrata cellule erano in grado di resistere uccisione da parte THP-1 macrofagi ed hanno subito un moderato 5 - a 7 volte maggiore CFU dopo 24 ore di coculturing con THP-1 macrofagi 8. Replica intracellulare di cellule di tipo selvatico, trasformate con GF.......
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Discussione
Sistema immune innato svolge un ruolo importante nel controllo delle infezioni fungine opportunistiche. I macrofagi contribuiscono alla difesa antimicotici per ingestione e la distruzione del patogeno fungino. Così, delucidazione di fattori che sono necessari per la sopravvivenza e / o contrastare le funzioni antimicrobiche di macrofagi avanzerà la nostra comprensione delle strategie di virulenza fungine. In questo contesto, abbiamo stabilito un sistema cellulare modello vitro in coltura utilizzando macrofagi d.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da Innovative Giovane Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 e BT/PR13289/BRB/10/745/2009 concessione dal Dipartimento di Biotecnologie, Governo dell'India e dei fondi fondamentali del Centro per l'impronta digitale del DNA e diagnostica, Hyderabad. MNR e GB sono i destinatari di Junior e Senior Research Fellowships del Consiglio di ricerca scientifica e industriale verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell'Università Manipal. SB è il destinatario di Junior e Senior Research Fellowship del Dipartimento di Biotecnologie verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell'Università Manipal.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| THP-1 | Collezione di colture di tipo americano | TIB 202 | Linea cellulare di leucemia monocitica acuta umana |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | Per il mantenimento delle cellule THP-1 |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato | Sigma-Aldrich | P 8139 | Attenzione: YPD pericoloso |
| BD-Difco | 242710 | Per la crescita di cellule Candida glabrata | |
| Formaldeide | Sigma-Aldrich | F8775 | Per la fissazione di macrofagi THP-1 infetti da C. glabrata |
| salina tamponata con fosfato (PBS) | Tampone (137 mM NaCl, 10 mM Fosfato, 2,7 mM KCl, pH 7,4) per lavaggi | ||
| Citrato salino-sodio (SSC) | Tampone (3 M NaCl, 0,3 M di citrato di sodio per una concentrazione 20x) per lavaggi | ||
| Tampone | Tampone (50% formammide, 5x Denhardt' soluzione s, 5x SSC, 1% SDS) per ibridazione | ||
| Terreno di montaggio VECTASHIELD | Vector Labs | H-1200 | Per il montaggio di vetrini per microscopia confocale |
| 32P marcato α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | Per la radiomarcatura di etichette di firma |
| Piastre per colture tissutali da 100 mm | Corning | 430167 | Per la coltura di cellule THP-1 |
| Piastra per colture tissutali a 24 pozzetti | Corning | 3527 | Per eseguire studi di infezione da C. glabrata in macrofagi THP-1 |
| vetrino trattato con coltura tissutale a 4 camere | BD Falcon | REF354104 | Per l'imaging C. glabrata-infected THP-1 macrofagi |
| Emocitometro | Rohem India | Per l'enumerazione delle cellule | |
| Microcentrifuga da tavolo | Beckman Coulter | Microfuge 18 | Per la centrifuga di cellule in microprovette |
| Centrifuga da tavolo | Remi | R-8C | Per la centrifuga di cellule in provette da 15 ml |
| Spettrofotometro | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | Per monitorare l'assorbanza delle cellule di lievito |
| Incubatore a piastre | Labtech | Refrigerato | Per la crescita di cellule C. glabrata |
| Incubatore shaker | New Brunswick | Innova 43 | Per coltivare cellule C. glabrata |
| Incubatore CO2 Thermo | Electron Corporation | Forma serie 2 | Per coltivare cellule THP-1 |
| Microscopio confocale | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | Per osservare C. glabrata-infettato THP-1 macrofagi |
| Microscopio composto | Olympus | CKX 41 | Per osservare C. glabrata e THP-1 macrofagi |
| Macchina PCR | BioRad | DNA Motore | Per amplificare tag unici da input e output genomico DNA |
| Forno di ibridazione | Labnet | Problot 12S | Per l'ibridazione |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | Per la scansione di membrane ibridate |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | Per la denaturazione di etichette di firma radiomarcate |
| Unità di documentazione su gel | Alphainnontech | Alphaimager | Per visualizzare il DNA colorato con bromuro di etidio in gel di agarosio |
Riferimenti
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance stu....
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Ristampe e permessi
