Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l'automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.
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Articolo metodologico
Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnica del patch-clamp è oggi il metodo più consolidata per la registrazione dell'attività elettrica di singoli neuroni o dai loro compartimenti subcellulari. Tuttavia, ottenere registrazioni stabili anche da cellule singole, rimane un tempo procedura di notevole complessità. Automazione di molti passi in congiunzione con display informativo efficiente potranno agevolare sperimentali in esecuzione di un numero maggiore di registrazioni con una maggiore affidabilità e in meno tempo. Per conseguire registrazioni su larga scala abbiamo concluso l'approccio più efficiente non è di automatizzare completamente il processo ma per semplificare le fasi sperimentali e ridurre le possibilità di errore umano mentre efficientemente incorporando esperienza dello sperimentatore e feedback visivo. Con questi obiettivi in mente, abbiamo sviluppato un sistema computerizzato che centralizza tutti i controlli necessari per un esperimento di patch-clamp multi-elettrodo in una singola interfaccia, un commercbuona resa disponibile gamepad wireless, mentre la visualizzazione esperimento correlate di informazione e orientamento spunti sullo schermo del computer. Qui si descrivono le diverse componenti del sistema che ci ha permesso di ridurre il tempo necessario per raggiungere la configurazione di registrazione e sostanzialmente aumentare le possibilità di successo registrando un gran numero di neuroni contemporaneamente.
Introduzione
La capacità di registrare e stimolare diversi siti con precisione micrometrica è estremamente utile per sperimentalmente conseguire una migliore comprensione dei sistemi neuronali. Molte tecniche sono stati sviluppati per questo scopo ma nessuno consentire la risoluzione submillivolt realizzato con la tecnica patch-clamp, essenziale per lo studio dell'attività sottosoglia e singoli potenziali postsinaptici. Qui copriamo lo sviluppo di un sistema di patch-clamp dodici elettrodi assistita da computer volto a registrare simultaneamente e stimolare un gran numero di singole cellule con precisione sufficiente per lo studio della connettività neuronale. Mentre molte al....
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Protocollo
1. Preparazione del materiale
- Manipolatori di comando da un computer
- Collegare ogni casella di controllo micromanipolatore ad un computer tramite porte seriali (RS-232).
- Implementare i comandi per il posizionamento, l'interrogazione e la regolazione delle impostazioni da inviare tramite la porta seriale. Problemi di velocità e compatibilità hardware fornite C / C + + è raccomandato come linguaggio di programmazione.
- Standardizzare il sistema di riferimento dei manipolatori modo che lo zero è la posizione più vicina possibile rispetto ai motori e movimento positivo è diretto lontano dai motori.
- Posizio....
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Risultati
Seguendo i metodi descritti sopra siamo riusciti a eseguire la registrazione a cellula intera fino a dodici neuroni simultaneamente, quasi raddoppiando il maggior numero di neuroni simultaneamente patch-bloccato finora. Esempi di reti di connessioni sinaptiche diretti tra piramidale neuroni registrati in strato V della corteccia somatosensoriale di ratti sono mostrati in Figura 6.
La determinazione dei profili di probabilità connessione in funzione della distanza inter-somat.......
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Discussione
Una domanda immediata di solito si pone per quanto riguarda il tasso di successo della procedura che abbiamo descritto. Per le alte percentuali di successo preparazione è essenziale. Le pipette devono avere aperture di punta che sono adeguati per le cellule degli esseri registrati. Filtrare la soluzione intracellulare per evitare pipette ostruiti è anche importante. Estremamente pulite, pipette appena tirato sono un altro requisito. Una distribuzione binomiale è il modello più semplice che può essere utilizzato per capi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, e Sonia Garcia per preziosi consigli sul miglioramento della procedura di automazione patch-clamp. Ringraziamo Rajnish Ranjan per la consulenza e l'assistenza con l'implementazione software di valore. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal progetto Synapse UE e in parte dal Programma di Scienza Human Frontiers.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio | Olympus | BX51WI | 40X Manipolatori con obiettivo ad immersione |
| Luigs Neumann | SM-5 | Protocollo seriale utilizzato | |
| Amplificatori | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK utilizzato |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | Uscita analogica BNC |
| Framegrabber | Traduzione dati | DT3120 | SDK utilizzato |
| Oscilloscopi | Tektronix | TDS 2014 | Comunicazione seriale |
| Acquisizione dati | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Acquisizione dati | National Instruments | PCI-6221 | Libreria utilizzata (.dll) |
| Valvola | di pressione SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Sensore di pressione | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrana pompa | Schego | Optimal |
Riferimenti
- Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS ....
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Ristampe e permessi
