Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

Sommario

Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l'automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.

Abstract

La tecnica del patch-clamp è oggi il metodo più consolidata per la registrazione dell'attività elettrica di singoli neuroni o dai loro compartimenti subcellulari. Tuttavia, ottenere registrazioni stabili anche da cellule singole, rimane un tempo procedura di notevole complessità. Automazione di molti passi in congiunzione con display informativo efficiente potranno agevolare sperimentali in esecuzione di un numero maggiore di registrazioni con una maggiore affidabilità e in meno tempo. Per conseguire registrazioni su larga scala abbiamo concluso l'approccio più efficiente non è di automatizzare completamente il processo ma per semplificare le fasi sperimentali e ridurre le possibilità di errore umano mentre efficientemente incorporando esperienza dello sperimentatore e feedback visivo. Con questi obiettivi in ​​mente, abbiamo sviluppato un sistema computerizzato che centralizza tutti i controlli necessari per un esperimento di patch-clamp multi-elettrodo in una singola interfaccia, un commercbuona resa disponibile gamepad wireless, mentre la visualizzazione esperimento correlate di informazione e orientamento spunti sullo schermo del computer. Qui si descrivono le diverse componenti del sistema che ci ha permesso di ridurre il tempo necessario per raggiungere la configurazione di registrazione e sostanzialmente aumentare le possibilità di successo registrando un gran numero di neuroni contemporaneamente.

Introduzione

La capacità di registrare e stimolare diversi siti con precisione micrometrica è estremamente utile per sperimentalmente conseguire una migliore comprensione dei sistemi neuronali. Molte tecniche sono stati sviluppati per questo scopo ma nessuno consentire la risoluzione submillivolt realizzato con la tecnica patch-clamp, essenziale per lo studio dell'attività sottosoglia e singoli potenziali postsinaptici. Qui copriamo lo sviluppo di un sistema di patch-clamp dodici elettrodi assistita da computer volto a registrare simultaneamente e stimolare un gran numero di singole cellule con precisione sufficiente per lo studio della connettività neuronale. Mentre molte altre applicazioni possono essere concepite per un tale sistema, si presta particolarmente bene allo studio della connettività sinaptica dato che il numero di possibili connessioni all'interno di un gruppo di neuroni cresce proporzionalmente al quadrato del numero di neuroni in questione. Pertanto, mentre un sistema a tre elettrodi consente di testare l'verificarsi di fino a sei connessioni e più spesso registrando una sola, registrazione dodici neuroni consente di testare la presenza di fino a 132 connessioni e frequentemente osservando oltre un dozzina (Figura 1). L'osservazione di decine di connessioni contemporaneamente rende possibile analizzare l'organizzazione delle piccole reti e dedurre le proprietà statistiche della struttura di rete che non può essere sondato altrimenti ^1. Inoltre, la stimolazione precisa di numerose cellule permette anche la quantificazione del reclutamento di cellule postsinaptici ^2.

Protocollo

1. Preparazione del materiale

1. Manipolatori di comando da un computer
   1. Collegare ogni casella di controllo micromanipolatore ad un computer tramite porte seriali (RS-232).
   2. Implementare i comandi per il posizionamento, l'interrogazione e la regolazione delle impostazioni da inviare tramite la porta seriale. Problemi di velocità e compatibilità hardware fornite C / C + + è raccomandato come linguaggio di programmazione.
   3. Standardizzare il sistema di riferimento dei manipolatori modo che lo zero è la posizione più vicina possibile rispetto ai motori e movimento positivo è diretto lontano dai motori.
   4. Posizionare il microscopio nella posizione centrale di 2 mm dal piano focale campione (coordinate [0, 0, 2000]).
   5. Memorizzare, per ciascun manipolatore, le coordinate locali che consentono alla punta di una pipetta da osservare al centro del campo visivo del microscopio. Questo è il punto di riferimento iniziale per ciascun elettrodo.
2. Visuaposizioni degli elettrodi. Lize è molto utile essere in grado di monitorare la posizione di ciascun elettrodo durante un esperimento. Una rappresentazione grafica è il modo più intuitivo di realizzare questo. A tal fine i sistemi di riferimento di ciascun elettrodo e quella del microscopio devono corrispondere. Un modo semplice per farlo è:
   1. Portare la punta di un elettrodo al centro del campo visivo.
   2. Memorizzare la posizione su ciascun asse del manipolatore e ciascun asse del microscopio.
   3. Eseguire con l'asse x del manipolatore relativamente grande movimento (1 mm).
   4. Individuare la punta ancora una volta muovendo solo il microscopio.
   5. Calcolare la differenza nella posizione microscopio sin dall'ultimo misurata. Queste sono le proiezioni del movimento dell'asse elettrodo sugli assi microscopio.
   6. Ripetere i passaggi 2,3-2,5 per gli assi Y e Z del manipolatore elettrodo. Ciò consente una matrice di proiezioni sul microscopio assi da determinare ( Figura 2), detta anche matrice coseno:
      
   7. Invertire questa matrice per permettere di calcolare i movimenti, in tre dimensioni, richieste dal manipolatore elettrodo per raggiungere una determinata posizione nel microscopio sistema di coordinate:
      
   8. Utilizzo del punto di riferimento iniziale e la matrice coseno determinare la posizione di ciascun elettrodo di microscopio coordinate.
   9. Visualizzare graficamente, basato sul microscopio coordinate, la posizione di ciascun elettrodo a intervalli regolari. Abbiamo scelto di utilizzare / C + + librerie di disegno C (GDI +) per disegnare le posizioni degli elettrodi ogni 40 msec.
   10. Ripetere i punti 1.2.1 - 1.2.7 ogni volta angoli manipolatori vengono modificate o se sono necessari cambiamenti di posizione di alcuni millimetri, ad esempio, quando il tipo di elettrodo viene modificato.
3. Abilitare la memorizzazione del positions di caratteristiche rilevanti nel tessuto, come le cellule oi punti di riferimento anatomici, in microscopio coordinate.
4. Acquisire video e sovrapporre le informazioni pertinenti.
   1. Meccanicamente allineare l'asse x del moto del microscopio con l'asse orizzontale della fotocamera microscopio.
   2. Installare sul computer di un framegrabber con video dal vivo e la capacità di sovrapposizione e di un kit di sviluppo software (SDK).
   3. Implementare funzionamento display video in tempo reale con l'SDK.
   4. Convertire il sistema di coordinate microscopio al sistema di riferimento telecamera la traduzione scala appropriato.
   5. Disegnare le caratteristiche rilevanti in coordinate fotocamera e overlay sul video dal vivo l'immagine risultante a intervalli regolari di circa 40 msec (Figura 3).
5. Amplificatori di controllo.
   1. Utilizzare il software amplificatore per controllare le impostazioni dell'amplificatore dall'interfaccia.
6. Control oscilloscopi.
   1. Collegare gli oscilloscopi al PC tramite porte seriali.
   2. Determinare la scala dell'oscilloscopio, accoppiamento e risoluzione temporale per le varie fasi della procedura di patch-clamp in voltage-clamp (es elettrodo in bagno, formazione sigillo, configurazione whole-cell) e corrente-clamp.
   3. Inviare i comandi di impostazione dell'oscilloscopio appropriati ogni volta i comandi di amplificazione vengono emessi dall'interfaccia.
7. Controllo della pressione pipetta.
   1. Assemblare un sistema di controllo pressione secondo la figura 4.
      1. Utilizzare un alimentatore 12 V / 5 V per fornire ogni componente elettronico in modo appropriato.
      2. Collegare l'uscita di una pompa a membrana per il tampone di pressione positiva (un contenitore 100 ml).
      3. Collegare l'ingresso di una pompa a membrana per il tampone di pressione negativa (un contenitore 100 ml).
      4. Collegare il tubo titolare pipetta di un sensore di pressione nella pressiori sistema di controllo e una valvola pneumatica che collega al vano pressione principale.
      5. Collegare ciascuno dei buffer di pressione per una valvola collegata al vano pressione principale.
      6. Collegare una valvola tra il vano di pressione principale e l'atmosfera.
      7. Collegare un sensore di pressione al compartimento pressione principale.
      8. Collegare un sensore di pressione per ogni buffer.
      9. Collegare il sistema di controllo della pressione per una scheda di acquisizione dati.
      10. Collegare ogni sensore di pressione ad un ingresso analogico.
      11. Collegare ogni valvola a un'uscita digitale.
   2. Rimuovere offset da tutti i sensori attraverso le valvole tranne quelli che collegano le pompe a membrana e sottraendo la pressione misurata pressione atmosferica.
   3. Implementare il controllo della pressione
      1. Definire nell'interfaccia un controllo per attivare o disattivare il controllo pressione positiva per ogni pipetta.
      2. Definire una pressione positiva minima per la pipettas di circa 70 mbar.
      3. Periodicamente (ogni 0,5 sec) rileva ogni volta la pressione in pipette sotto controllo la pressione attiva scende sotto la soglia impostata.
      4. Al superamento della soglia aprire il tampone di pressione positiva al vano pressione principale e il vano verso la pipetta in questione durante brevi periodi (20 msec) finché la pressione nelle pipette è sopra la soglia. Chiudere tutte le altre valvole.
      5. De-attivare un ulteriore controllo pressione viene avviato l'approccio finale verso una cella di interesse.
   4. Applicare una pressione negativa per la formazione di tenuta
      1. Chiudere tutte le valvole e aprire la valvola tampone di pressione negativa verso il vano di pressione principale e questo comparto verso la pipetta in questione per tutta la durata dello sperimentatore richiede mantenendo un pulsante premuto.
8. Centralizzare i comandi su un dispositivo di interfaccia umana.
   1. Collegare un wirele disponibile in commercioss gamepad al PC.
   2. Implementare lettura dello stato joystick. Ad esempio, utilizzare le librerie DirectX per C / C + + per eseguire letture ogni 5 msec.
   3. Confronta stato attuale con lo stato precedente di rilevare che sono stati premuti pulsanti, rilasciato o tenuto premuto dal passo ultima volta.
   4. Assegnare le funzioni a ciascun pulsante del gamepad. Un esempio di questa mappatura è mostrata in Figura 5.

2. Patch-clamp procedura

1. Preparare le fette di cervello della regione di interesse.
2. Mettere una fetta cervello di interesse, con la regione di interesse nel centro del range di spostamento del microscopio.
3. Selezione delle cellule
   1. Identificare le cellule di interesse navigando con il microscopio. Memorizzare la posizione delle celle in base al sistema di coordinate microscopio con un destro del mouse sul display video dal vivo in cima alla cella di interesse.
   L'interfaccia grafica visualizza le celle selezionate nonché le micropipette per una visione globale e il software aggiungerà un indicatore sulla posizione della cella che verrà sovrapposta alle immagini. Inoltre, l'immagine della cella viene catturata per riferimento futuro nel file 'Cella #. Jpg'.

Attribuzione delle cellule di pipette

1. Dopo aver selezionato le cellule di interesse, assegnare pipetta che registrerà ogni cella. L'interfaccia grafica fornisce i controlli di assegnazione che devono essere impostati. Visualizza un'anteprima della configurazione finale selezionando la casella "Visualizza posizioni finali '.
2. Selezionare ogni pipetta per i quali l'anteprima posizione finale è desiderato o selezionare la casella di controllo 'Seleziona tutto'. Disattivare la visualizzazione della posizione corrente per una migliore visualizzazione, se necessario.

Preparare le Pipettes

1. Riempire le pipette (6-8 mW di solito sono migliori se si utilizzano molte pipette) with soluzione intracellulare e caricarli nelle loro proprietari. Mettere le headstages nelle loro fissazioni, ma non farle scorrere in avanti per evitare di toccare la vasca da bagno con la punta della pipetta.
2. Abilitare il controllo della pressione positiva e selezionare tutte le pipette per assicurare che le punte rimarranno puliti. Far scorrere delicatamente ogni headstage a posto.

Individuazione dei puntali delle pipette

1. Posizionare il microscopio in una posizione centrale, con messa a fuoco 3 mm sopra la fetta premendo il tasto R2 mentre si tiene il tasto 'A'. Utilizzare la posizione corrispondente per ogni manipolatore come memorizzato dal precedente esperimento premendo il tasto L2 tenendo premuto il pulsante A.
   Nota: A questo punto non ci dovrebbero essere né ombra distintivo di una pipetta in vista o un piccolo movimento lungo l'asse della pipetta dovrebbe essere sufficiente osservare che nella maggioranza dei casi. Compensazione per le lievi differenze di forma pipetta deve essere effettuata manualmente.
2. Portare la punta della pipetta a fuoco. Posizionare la punta sul punto centrale rosso del display video senza spostare il microscopio (dovrebbe essere ancora in posizione [0, 0 2000]).
3. Informare il software che la pipetta è al centro del display premendo il tasto Z tenendo premuto il tasto C. Dopo ogni punta della pipetta si trova, inviare tale pipetta all'indietro in modo che il successivo può essere posizionato premendo il tasto L1 tenendo premuto il pulsante A.

Avvicinandosi le cellule

1. Una volta che tutti i puntali delle pipette sono stati localizzati con precisione e ogni pipetta viene attribuito a una cella, posizionare automaticamente le pipette vicino alle loro rispettive celle. Basta fare clic destro nel centro del gruppo di celle e selezionare l'opzione 'Cluster' nel menu a comparsa. Nella finestra delle opzioni del cluster che apparirà, selezionare tutte le pipette che si desidera posizionare in questo periodo e clicca su 'Vai con tutte le pipette controllati'. Ripetere questa operazione per ogni cluster di cellule di interesse.
2. Perform l'approccio finale manualmente. La posizione delle pipette relativi alle cellule può essere specificato in modo diverso, ma di solito è semplicemente 200 micron dalla cella nell'asse della pipetta e 200 micron superiore nella direzione verticale, che è sufficiente a mantenere la punta della pipetta fuori del tessuto . Attendere che il posizionamento delle pipette è finito e spostare il microscopio verso una pipetta premendo il tasto R1 tenendo premuto il tasto C.
3. Ricalibrare ogni posizione pipetta puntando il microscopio sulla punta in qualsiasi parte del display video e premendo il tasto B mentre si tiene il pulsante C. Una griglia quadrata dovrebbe brevemente indica la posizione individuata della pipetta. Se la posizione non è corretta, posizionare la punta sul punto centrale del display video e premere il pulsante Z tenendo premuto il tasto C.

Stabilire la configurazione cell-attached

1. Verificare che la cella di interesse per la pipetta corrente è correttomarcata. In caso contrario, spostare il microscopio per abbinare la cella di interesse con il puntino rosso centrale. Segna la cella premendo il tasto Y mentre si tiene il pulsante C. Premere il tasto L2 tenendo premuto il tasto C per posizionare la pipetta 200 micron di distanza dal suo cellulare assegnata, il microscopio si sposterà automaticamente nella posizione corrispondente.
2. Regolare la posizione della pipetta in modo che corrisponda il punto rosso. Regolare l'offset premendo il tasto R1 tenendo premuto il tasto X. pipetta
3. Attivare l'impulso di test premendo il tasto L1 tenendo premuto il tasto X. lentamente avvicinare la pipetta alla sua cellula attribuito.
4. Osservando la formazione di una fossetta sulla superficie della membrana della cellula applicare un breve impulso di pressione negativa premendo il tasto Y tenendo premuto il pulsante Z per consentire la pressione applicata per raggiungere la cella. Un potenziale di circa-65mV possesso dovrebbe istituito a questo punto premendo il tasto L2 tenendo premuto il tasto X.

Configurazione whole-cell

1. Una volta che un Giga-sigillo è formato per ogni cella, iniziare la rottura delle membrane applicando pressione negativa.

Eseguire le registrazioni

1. Utilizzare il sistema di stimolazione / acquisizione di effettuare le registrazioni. Applicare impulsi o treni di impulsi in un'unica singola cella alla volta e osservare risposte delle cellule rimanenti per mappare connettività tra le cellule registrati.

Recedere pipette

1. Una volta che le registrazioni sono finite, recedere pipette lentamente dal tessuto facendo clic destro sulla radio-pulsante Tabella. Selezionare 'recedere-> Pipettes 500 micron' di avere le pipette retrocedono a breve distanza lungo i loro assi. Osservare la deriva del potenziale delle cellule (compensazione i consigli applicando una certa pressione positiva può aiutare).
2. Per recedere pipette per tutto il tragitto, impostare la velocità di posizionamento di 'Fast' e ripetere la stessa operazione, ma scegliere l'opzione 'All'. Rimuovere l'usatopipette scorrendo le headstages e svitando le pipette da parte dei titolari. E 'utile per evitare torsioni titolari nelle loro prese poiché questo potrebbe notevolmente interferire con la posizione della punta della pipetta.

Risultati

Seguendo i metodi descritti sopra siamo riusciti a eseguire la registrazione a cellula intera fino a dodici neuroni simultaneamente, quasi raddoppiando il maggior numero di neuroni simultaneamente patch-bloccato finora. Esempi di reti di connessioni sinaptiche diretti tra piramidale neuroni registrati in strato V della corteccia somatosensoriale di ratti sono mostrati in Figura 6.

La determinazione dei profili di probabilità connessione in funzione della distanza inter-somat...

Discussione

Una domanda immediata di solito si pone per quanto riguarda il tasso di successo della procedura che abbiamo descritto. Per le alte percentuali di successo preparazione è essenziale. Le pipette devono avere aperture di punta che sono adeguati per le cellule degli esseri registrati. Filtrare la soluzione intracellulare per evitare pipette ostruiti è anche importante. Estremamente pulite, pipette appena tirato sono un altro requisito. Una distribuzione binomiale è il modello più semplice che può essere utilizzato per capi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio	Olympus	BX51WI	40X Manipolatori con obiettivo ad immersione
	Luigs Neumann	SM-5	Protocollo seriale utilizzato
Amplificatori	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK utilizzato
Camera	Till Photonics	VS 55	Uscita analogica BNC
Framegrabber	Traduzione dati	DT3120	SDK utilizzato
Oscilloscopi	Tektronix	TDS 2014	Comunicazione seriale
Acquisizione dati	InstruTECH	ITC 1600
Acquisizione dati	National Instruments	PCI-6221	Libreria utilizzata (.dll)
Valvola	di pressione SMC	SMC070C-6BG-32
Sensore di pressione	Honeywell	24PCDFA6G
Membrana pompa	Schego	Optimal