La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

Summary

Due metodi complementari basati sulla citometria di flusso e microscopia sono presentati che consentono la quantificazione, a livello di singola cellula, delle dinamiche di espressione genica indotte dall'attivazione di una via MAPK in lievito.

Abstract

La quantificazione dell'espressione genica a livello di singola cellula svela nuovi meccanismi di regolamentazione oscurate nelle misurazioni effettuate a livello di popolazione. Due metodi basati sulla microscopia e citometria a flusso sono presentati per illustrare come tali dati possono essere acquisiti. L'espressione di un reporter fluorescente indotto all'attivazione della elevata osmolarità glicerolo MAPK in lievito è usato come esempio. I vantaggi specifici di ciascun metodo sono evidenziati. Flusso misura citometria un gran numero di cellule (10.000) e fornisce una misura diretta delle dinamiche di espressione proteica indipendente delle lenti cinetica di maturazione della proteina fluorescente. Imaging di cellule viventi mediante microscopia è invece limitato alla misura della forma maturato del reporter in meno cellule. Tuttavia, le serie di dati generati da questa tecnica possono essere estremamente ricco grazie alle combinazioni di reporter multipli e alle informazioni spaziale e temporaleottenuto da cellule singole. La combinazione di questi due metodi di misurazione in grado di fornire nuove intuizioni sulla regolazione dell'espressione proteica mediante vie di segnalazione.

Introduction

Segnalazione via cascate di trasduzione spesso culmina nella espressione di proteine. La caratterizzazione di questo profilo di espressione è un elemento chiave per comprendere la funzione di percorsi biologici. L'identificazione dello spettro di up-regolata proteine ​​e le dinamiche della loro attivazione può essere ottenuto attraverso diverse tecniche come micro-array, Northern blot o western blot ^1-3. Tuttavia, queste tecniche media la risposta di un'intera popolazione di cellule. Per comprendere la regolazione fine della espressione delle proteine, è desiderabile raccogliere misurazioni a livello di singola cellula. Idealmente, queste misure do....

Protocol

1. Misure Microscopia

1. Inoculare 5 ml di terreno sintetico con il lievito.
2. Crescere le cellule a 30 ° C per una notte.
3. Misurare il diametro esterno ₆₀₀ della cultura durante la notte la mattina successiva.
4. Diluire cultura durante la notte in mezzo sintetico 5 ml di OD ₆₀₀ 0.05.
5. Far crescere la cultura diluito a 30 ° C per almeno 4 ore.
6. Preparare 3 volte concentrato (0,6 M) soluzione di NaCl in terreno sintetico.
7. Preparare una soluzione 1 mg / ml di Concanavalina A (ConA) in PBS.
8. Filtrato ~ 200 ml di soluzione di ConA nella diapositiva bene.
9. Lasciate riposar....

Results

Microscopia

Le cellule di lievito recanti l'espressione giornalista STL1 p-q V (ySP9 ⁷⁾ sono stati attaccati al fondo del pozzo scorrevole e posti sotto il microscopio. Le cellule sono state stimolate con l'aggiunta di mezzo sollecitazioni direttamente nel pozzo nel corso della sessione di imaging. Questo ci permette di acquisire alcune immagini delle cellule prima dell'induzione percorso e seguiamo il loro destino dopo la stimolazione. Nella fattispecie, le cellule sono sta.......

Discussion

Microscopia

Il trattamento del pozzetto con ConA è un passo essenziale per assicurare una corretta rappresentazione delle cellule. Poiché ConA ha una bassa solubilità in PBS (5 mg / ml), il processo di filtrazione permette la rimozione di grandi aggregati che sono presenti nella soluzione filtrata e interferiscono con l'imaging. Cellule attribuiscono relativamente fortemente alla superficie trattata e l'aggiunta della soluzione indurre non dovrebbero disturbare la localizzazione delle c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Yeast Nitrogen
CSM miscela di aminoacidi	PerMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruplo V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Software di controllo del microscopio	Micro-manager	Ver 1.4.11
Camera di incubazione	LIS	The Box
Luce a fluorescenza fonte	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Citometro	a flusso BD	FACS calibur
Bagno sonicatore	Telesonic	TUC-150
Thermo Lab-tek	8 pozzetti	155409
96 pozzetti	bioscienze matrici	MGB096-1-2-LG
FACS tubo rigido	BD Falcon	352054