Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

I biofilm sono comunità microbiche strutturate che sono incapsulate in una matrice extracellulare autoprodotta e sono attaccate a superfici biologiche o inerti¹. I biofilm rappresentano uno stile di vita comune per molti batteri e si formano passando in fasi da cellule fluttuanti (planctoniche) a complesse comunità multispecie. La resistenza intrinseca dei biofilm agli agenti antimicrobici è alla base di molte infezioni batteriche persistenti e croniche^1,2, come dimostrato dai biofilm orali (placca dentale). I microrganismi cariogeni come gli streptococchi mutans processano il saccarosio e altri carboidrati per produrre una matrice extracellulare e generare acidi che possono demineralizzare la struttura del dente e causare carie dentale. La maggior parte delle matrici di biofilm sono biopolimeri costituiti da componenti cellulari ed extracellulari come esopolisaccaridi (EPS), proteine e acidi nucleici^3,4.

Microscopia a scansione laser confocale (CLSM), la tecnica più utilizzata per l'imaging a fluorescenza, ha trasformato radicalmente l'imaging ottico in biologia perché ha la capacità di raccogliere immagini 3D di strutture biologiche idratate senza fissazione^5,6,7. Questa tecnica non distruttiva prevede la raccolta di immagini di sezioni sottili all'interno di una regione di interesse sul campione in modo tale da rimuovere il contributo della luce sfocata. La qualità e la risoluzione delle immagini acquisite con CLSM sono superiori a quelle ottenibili con la microscopia a fluorescenza a campo largo. Uno dei principali svantaggi del CLSM è che la scansione delle immagini avviene a una velocità inferiore rispetto alle tecniche di microscopia a campo largo, in cui intere immagini vengono raccolte contemporaneamente⁵. Tuttavia, con una selezione sempre più ampia di fluorocromi, laser e filtri, il CLSM è diventato una delle tecniche prevalenti per l'imaging multispettrale^5,7.

Studi precedenti hanno dimostrato che il CLSM è uno strumento utile per esaminare la struttura o l'architettura dei biofilm utilizzando uno o due tag o coloranti fluorescenti per fornire una migliore comprensione della distribuzione di EPS e cellule all'interno dei biofilm, e in particolare all'interno della matrice extracellulare^7,8. In teoria, la colorazione/marcatura fluorescente di più componenti è auspicabile per esplorare la struttura dettagliata e la colocalizzazione di componenti cellulari ed extracellulari all'interno dei biofilm. Tuttavia, l'analisi concomitante di vari componenti all'interno dei biofilm può essere impegnativa perché: 1) la selezione di coloranti fluorescenti con una sovrapposizione spettrale minima è complicata e 2) la quantificazione di più fluorocromi pone un problema multifattoriale. La colocalizzazione con più fluorocromi richiede l'uso di coloranti altamente specifici con un'interferenza spettrale minima per evitare qualsiasi effetto di sanguinamento, che si verifica quando due fluorocromi hanno una sovrapposizione significativa nel loro picco spettrale, causando una maggiore eccitazione di uno rispetto agli altri⁹. Idealmente, i fluorocromi con spettri di eccitazione che non si sovrappongono fornirebbero i migliori risultati, tuttavia è molto difficile trovare coloranti che soddisfino questo criterio. Invece, la selezione dei coloranti è ottimizzata scegliendo fluorocromi i cui spettri di emissione hanno una sovrapposizione minima, consentendo di visualizzare i coloranti uno per uno all'interno di una banda di lunghezze d'onda di osservazione limitata⁹.

La sovrapposizione di immagini a fluorescenza è probabilmente il metodo più utilizzato per valutare la distribuzione concomitante dei fluorocromi. La colocalizzazione dei vari componenti appare come una sovrapposizione di colori diversi attraverso più canali creati dai fluorocromi in esame¹⁰. Gli strumenti per la visualizzazione di immagini a fluorescenza multicanale come immagini a colori unite sono disponibili nella maggior parte dei software CLSM e dei software di analisi delle immagini biologiche. Sebbene la sovrapposizione di immagini sia utile per la valutazione spaziale della colocalizzazione, le immagini possono essere esaminate qualitativamente solo mediante analisi visiva. Ciò fornisce una quantità limitata di informazioni, poiché queste rappresentazioni non sono generalmente utili per quantificare la colocalizzazione in diverse condizioni sperimentali né determinano se la colocalizzazione supera la coincidenza casuale¹¹. Pochissime indagini finora hanno utilizzato metodi quantitativi per analizzare la struttura tridimensionale dei biofilm e dei componenti del biofilm, e ancora meno hanno quantificato l'effetto dei trattamenti antibatterici o delle misure antivegetative sui componenti del biofilm.

L'obiettivo di questo studio era quello di riportare una metodologia per la quantificazione e il confronto delle distribuzioni tridimensionali concomitanti di tre componenti cellulari ed extracellulari dei biofilm. Il metodo consiste in fasi distinte ma interconnesse che coinvolgono la crescita del biofilm, la colorazione, l'imaging CLSM dei biofilm, l'analisi e la visualizzazione strutturale del biofilm e l'analisi statistica dei parametri strutturali. Il saggio di crescita del biofilm consente la crescita del biofilm su substrati pertinenti e produce strutture di biofilm riproducibili. La combinazione di una nuova colorazione simultanea di EPS, proteine e componenti di acidi nucleici con la misurazione dei parametri strutturali del biofilm 3D si traduce in distribuzioni quantificabili dei componenti all'interno dei biofilm. L'analisi statistica dei parametri strutturali del biofilm facilita la valutazione dei biofilm in specifiche condizioni sperimentali (ad esempio dopo il trattamento con collutori), come verrà descritto nella prossima sezione.

1. Preparazione di terreni e reagenti

1. Preparare 300 ml di terreno di coltura notturno (THY; 3% di brodo Todd Hewitt preparato secondo le istruzioni del produttore integrato con lo 0,3% di estratto di lievito in acqua ultrapura) e autoclave. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 2 mesi.
2. Preparare 1 L di agar THY (3% di brodo Todd Hewitt, 0,3% di estratto di lievito e 1,5% di agar agar in acqua ultrapura), autoclavare e raffreddare a 60 °C prima di versare in piastre di Petri. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
3. Preparare 150 ml di terreno di crescita del biofilm (0,5X TY integrato con 10 mM di saccarosio, 1,5% di triptone, 0,5% di estratto di lievito e 10 mM di saccarosio in acqua ultrapura) e sterilizzare con filtro. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 1 mese.
4. Preparare 1 L di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na₂HPO₄ e 0,24 g di KH₂PO₄ in acqua ultrapura) e sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente per diversi mesi.
5. Preparare 600 ml di tampone Tris HCl da 10 mM integrato con 10 mM di CaCl₂ in acqua ultrapura (tampone TC; pH 7,2) e in autoclave. Conservare a temperatura ambiente per diversi mesi.
6. Autoclave 1 L di acqua ultrapura. Conservare a temperatura ambiente per diversi mesi.

2. Fabbricazione di campioni

1. Fabbricare campioni a forma di disco di compositi in resina dentale Point 4 (PF) e TPH³ (TP) in uno stampo in acciaio inossidabile su misura in due incrementi. Ogni incremento viene fotopolimerizzato per 40 secondi utilizzando un'unità di fotopolimerizzazione a LED. I due prodotti hanno composizioni e livelli di riempimento leggermente diversi e quindi producono topografie superficiali diverse su cui verranno coltivati i biofilm.
   1. Campioni di substrati rilevanti potrebbero essere fabbricati utilizzando protocolli stabiliti da altre discipline al posto del passaggio 2.1.
2. Rifinire e lucidare i campioni fino a ottenere una finitura superficiale finale accettabile, ad esempio utilizzando una smerigliatrice-lucidatrice semiautomatica. Sciacquare i campioni lucidati con acqua ultrapura e asciugare con aria compressa.
3. Sterilizzare i campioni utilizzando un gas di ossido di etilene o un metodo di sterilizzazione alternativo.

3. Crescita del biofilm

1. Inoculare una singola colonia di S. mutans in 4 ml di terreno di coltura notturno (fase 1.1). Incubare per una notte a 37 °C per 16-18 ore. La densità ottica (OD₆₀₀) della coltura deve essere ≥0,9.
   1. È meglio utilizzare una colonia proveniente da colture a piastre che sono state passate 2 volte da uno stock originale, in quanto ciò si traduce in una crescita più coerente del biofilm.
2. Creare una diluizione 1:100 utilizzando la coltura notturna (fase 1.1) in 10 ml di terreno di crescita del biofilm (fase 1.3).
3. Trasferimento di campioni compositi in resina sterili (ad es. PF, TP) su piastre sterili a 12 pozzetti.
4. Aggiungere 2,5 ml di terreno di coltura diluito (fase 3.2) ai pozzetti per il trattamento (collutorio) e ai gruppi di controllo. Aggiungere 2,5 ml di terreno di coltura sterile non inoculato per il biofilm ai pozzetti di controllo della sterilità.
5. Coltiva i biofilm in condizioni microaerofile. Posizionare le piastre su uno shaker a 100 giri/min all'interno di un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
6. Dopo 24 ore, aspirare asetticamente il terreno da tutti i pozzetti e lavare due volte con PBS sterile (fase 1.4; 2,5 ml/pozzetto), aspirando il PBS dopo ogni lavaggio. Reintegrare 2,5 ml di terreno di coltura del biofilm fresco in ciascun pozzetto e incubare per altre 24 ore in condizioni identiche a quelle della fase precedente, per un tempo di crescita totale del biofilm di 48 ore.
7. Al posto dei passaggi precedenti, i biofilm di altre specie potrebbero essere coltivati su substrati utilizzando protocolli stabiliti.

4. Trattamenti antibatterici/collutori

1. Aspirare il terreno dopo che la crescita del biofilm è completa.
2. Aggiungere 2,5 ml di collutorio Biotène PBF (BIO) o Listerine Total Care (LTO), o altra modalità di trattamento, nei pozzetti per i gruppi di trattamento e aggiungere 2,5 ml di acqua ultrapura sterile al pozzetto del gruppo di controllo. Immergere i campioni per 60 secondi, secondo le istruzioni del produttore, agitando le piastre su un agitatore orbitale a 150 giri/min. Aspirare immediatamente sia il collutorio che l'acqua ultrapura dai pozzi.
3. Lavare i campioni 5 volte per 15 secondi per lavaggio con acqua ultrapura sterile sull'agitatore orbitale a 150 giri/min, aspirando acqua dopo ogni fase di lavaggio.
4. Al posto dei passaggi precedenti, altri agenti antibatterici potrebbero essere testati utilizzando protocolli stabiliti.

5. Colorazione

1. Preparare le diluizioni dei coloranti per l'analisi del biofilm.
   1. Preparare una soluzione madre da 5 mg/ml di coniugato (FA) Concanavalin A, Alexa Fluor 647 in bicarbonato di sodio 0,1 M pH 8,3. Conservare a -20 °C in aliquote monouso per diversi mesi perché il congelamento e lo scongelamento sono sconsigliati. Utilizzando questa soluzione madre AF, preparare una diluizione di 250 μg/ml nel tampone TC.
   2. Preparare una diluizione di 10 μM utilizzando la soluzione madre Syto 9 (SY) da 5 mM, fornita dal produttore, in tampone TC. Conservare la soluzione madre SY rimanente a -20 °C per diversi mesi.
   3. Preparare una diluizione 10x utilizzando la soluzione madre Sypro Red 5.000x (SR), fornita dal produttore, in acqua ultrapura sterile. Conservare la soluzione madre SR rimanente a -20 °C per diversi mesi.
2. Lavare tutti i biofilm 2 volte con tampone TC (2,5 ml/pozzetto) con un movimento rotatorio della mano, lasciando che il secondo lavaggio rimanga nella piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare.
3. Posizionare una goccia di 50 μl di colorante AF su ciascun campione di biofilm. Colorare per 30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Lavare 2 volte con tampone TC (2,5 ml/pozzetto), aspirando dopo ogni lavaggio.
4. Seguire con una goccia di 50 μl di colorante SY su ciascun campione di biofilm. Colorare per 30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Lavare 2 volte con acqua ultrapura sterile (2,5 ml/pozzetto), aspirando dopo ogni lavaggio
5. Infine, posizionare una goccia di 50 μl di colorante SR su ciascun campione di biofilm. Colorare per 30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Lavare 3 volte con acqua ultrapura sterile (2,5 ml/pozzetto), aspirando dopo ogni lavaggio.
6. Trasferire i campioni in una piastra a 6 pozzetti, posizionando un campione per pozzetto in 6 ml di acqua ultrapura sterile per facilitare la microscopia confocale.

6. Imaging con microscopia a scansione laser confocale

1. Acquisire immagini di ciascun componente (colorazione) all'interno dei biofilm dei gruppi di trattamento e di controllo utilizzando le impostazioni del microscopio a scansione laser confocale mostrate nella Tabella 1. In questo studio è stata utilizzata una lente a immersione 63X con un'apertura numerica di 0,9 con una distanza di lavoro di 2,2 mm.
   
   Tabella 1. Impostazioni del microscopio a scansione laser confocale.

2. Impostare la dimensione della scansione su 250 μm x 250 μm e una risoluzione minima dei pixel di 512 x 512 per acquisire immagini CLSM a una risoluzione adeguata per l'analisi quantitativa.
3. Utilizzare la colorazione SY per impostare i punti superiore e inferiore della pila di immagini del biofilm, quindi impostare il passo z in modo che sia adeguato per l'analisi quantitativa (0,6 μm per questo studio). Prima di raccogliere una scansione, ottimizzare i parametri dell'immagine e della colorazione (ad es. tensione PMT e offset) utilizzando l'opzione QLUT. È stata utilizzata una tabella di ricerca dei colori per assegnare pseudo-colori a ciascuna colorazione (verde per SY, rosso per SR e blu per AF) al fine di rendere ogni componente del biofilm più distinguibile nella ricostruzione 3D.
4. Raccogli immagini CLSM a 400 Hz utilizzando la scansione sequenziale in modalità "tra le pile" per ottimizzare l'acquisizione di immagini di più macchie all'interno dello stesso biofilm.

7. Analisi strutturale del biofilm

1. Analizza le immagini CLSM raccolte utilizzando il software di analisi delle immagini per i biofilm. I passaggi seguenti descrivono l'uso del software ISA3D¹² per calcolare i parametri strutturali delle immagini del biofilm raccolte.
   1. Copiare i file immagine CLSM per ogni biofilm nella cartella Immagini, come specificato nel manuale del software. Assicurarsi che venga seguita la convenzione di denominazione per i file CLSM richiesta dal software. Il software consente l'analisi dei file all'interno delle sottocartelle in modalità batch, facilitando così l'analisi dei biofilm del trattamento e del gruppo di controllo nella stessa corsa.
   2. Immettere le dimensioni degli assi x, y e z delle immagini CLSM nei campi dxy e dz della finestra di dialogo principale. Selezionare le impostazioni di mappatura della soglia e della distanza, come descritto nel manuale del software (per questo studio sono stati utilizzati rispettivamente Otsu e Quasi-Euclidean). Immettere un nome appropriato per il file dei risultati, quindi eseguire il programma. Verrà prodotto un file dei risultati nella cartella ISA.
   3. Visualizza il file dei risultati per ottenere i valori di venti parametri strutturali 3D¹² come il biovolume e lo spessore medio del biofilm (misurati in questo studio) che quantificano la distribuzione 3D di ciascun componente (colorazione) all'interno del biofilm.

8. Visualizzazione della struttura del biofilm

1. Crea una ricostruzione dei componenti sovrapposti (macchie) all'interno di ciascun biofilm utilizzando il software di analisi delle immagini. I passaggi seguenti descrivono l'uso del software Volocity per creare ricostruzioni 3D.
   1. Creare una libreria per ogni biofilm copiando i file immagine CLSM nel software, come descritto nel manuale.
   2. Utilizzare l'opzione di menu Renderizzatore 3D per produrre un'immagine 3D ricostruita dalle immagini CLSM di ciascun biofilm (per questo studio è stato utilizzato il formato HR Opacità).
   3. Ruota l'immagine 3D per orientare tutti i biofilm in modo simile rispetto agli assi delle coordinate x, y e z. Cattura un'istantanea della ricostruzione del biofilm correttamente orientata, quindi esporta l'istantanea in TIFF, JPEG o altro formato adatto.
2. Eseguire l'analisi visiva della distribuzione concomitante di EPS, proteine e componenti di acidi nucleici all'interno dei biofilm sulle immagini ricostruite.
3. Utilizzare il coefficiente di correlazione di Pearson e il coefficiente di sovrapposizione di Manders per eseguire un'analisi di colocalizzazione di più componenti del biofilm (la colocalizzazione non è stata misurata in questo studio).

9. Analisi statistica

1. Utilizzare analisi statistiche separate di modelli misti per confrontare i valori medi dei parametri strutturali tra collutorio e gruppi di controllo (α=0,05). Per questo studio, è stato utilizzato il software SAS per eseguire l'analisi statistica.

I risultati rappresentativi per i trattamenti (collutori) e il gruppo di controllo non trattato sono mostrati nella Tabella 2 e nelle Figure 1 e 2. La tabella 2 mostra i valori medi e di deviazione standard dei parametri strutturali del biofilm, biovolume (μm3) e spessore medio del biofilm (μm) che sono stati calcolati utilizzando il software ISA3D. I parametri strutturali dei biofilm trattati con collutorio che differivano significativamente da quelli dei biofilm nel gruppo di controllo (p<0,05) hanno valori medi e di deviazione standard evidenziati in rosso. I risultati delle analisi statistiche dei modelli misti hanno dimostrato che il collutorio BIO produceva strutture di biofilm che differivano significativamente dal controllo (p<0,05) su entrambi i compositi di resina, mentre il collutorio LTO non produceva differenze significative (p>0,05) su entrambi i compositi di resina. I risultati mostrano chiaramente che i componenti del biofilm cellulare ed extracellulare rimanenti dopo i due trattamenti collutorio differivano. Va inoltre notato che i biofilm di S. mutans cresciuti sui due substrati (PF e TP) differivano nella struttura 3D anche se sono stati coltivati in condizioni simili ed entrambi i substrati sono stati lucidati con abrasivi simili.

La distribuzione simultanea di EPS, proteine e acido nucleico all'interno dei biofilm può essere visualizzata tramite le ricostruzioni 3D generate utilizzando il software Volocity. Le figure 1 e 2 dimostrano ricostruzioni rappresentative di biofilm del gruppo di controllo cresciuti rispettivamente su compositi di resina PF e TP. La colorazione blu rappresenta l'EPS all'interno dei biofilm di S. mutans, la macchia verde mostra gli acidi nucleici e la macchia rossa mostra le proteine. Lo spazio intermedio può essere occupato da acqua o da altri componenti di biofilm non marcati in fluorescenza.

Figura 1. Una ricostruzione 3D rappresentativa del biofilm di S. mutans coltivato su composito di resina PF nel gruppo di controllo (non trattato con collutorio). La sovrapposizione simultanea dei tre coloranti all'interno di un singolo biofilm consente la visualizzazione simultanea dei componenti EPS (colorazione blu), acido nucleico (colorazione verde) e proteine (colorazione rossa) all'interno dei biofilm di S. mutans. (1 unità = 24 μm). Clicca qui per visualizzare la cifra più grande.

Figura 2. Una ricostruzione 3D rappresentativa del biofilm di S. mutans coltivato su composito di resina TP nel gruppo di controllo (non trattato con collutorio). La sovrapposizione simultanea dei tre coloranti all'interno di un singolo biofilm consente la visualizzazione simultanea dei componenti EPS (colorazione blu), acido nucleico (colorazione verde) e proteine (colorazione rossa) all'interno dei biofilm di S. mutans. (1 unità = 24 μm). Clicca qui per visualizzare la cifra più grande.

Tabella 2. Valori medi e di deviazione standard del Biovolume (BV) e dello Spessore medio del biofilm (MT) di biofilm trattati con BIO o LTO, o non trattati (gruppo di controllo). I parametri strutturali dei biofilm trattati con collutori che differivano significativamente da quelli dei biofilm nel gruppo di controllo (p<0,05) hanno valori medi e di deviazione standard evidenziati in rosso.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. La produzione e l'accesso gratuito a questo articolo sono sponsorizzati da Leica Microsystems.