Il pesce zebra, un piccolo pesce tropicale, è diventata un modello importante per studiare la funzione del gene durante lo sviluppo dei vertebrati e la malattia. L'espressione temporale e spaziale dei geni bersaglio può essere determinata In situ Ibridazione. Nostra migliore protocollo permette l'individuazione di bassi trascritti abbondanti con basso segnale sfondo non specifico.
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Articolo metodologico
Alta Risoluzione intero monte
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo articolo si concentra su tutto il montaggio di ibridazione in situ (WISH) di embrioni di zebrafish. La tecnologia WISH facilita la valutazione dell'espressione genica sia in termini di distribuzione tissutale e stadio di sviluppo. Protocolli sono descritti per l'uso di DESIDERIO di embrioni di zebrafish utilizzando RNA antisenso sonde marcate con digossigenina. Le sonde sono generati da incorporare nucleotidi digoxigenin-linked attraverso la trascrizione in vitro su modelli genetici che sono stati clonati e linearizzato. Le chorions di embrioni raccolte a stadi di sviluppo definiti vengono rimossi prima dell'incubazione con sonde specifiche. A seguito di una procedura di lavaggio per rimuovere la sonda in eccesso, gli embrioni vengono incubate con anticorpo anti-digossigenina coniugata con fosfatasi alcalina. Impiegando un substrato cromogenico della fosfatasi alcalina, specifica espressione genica può essere valutata. A seconda del livello di espressione genica l'intera procedura può essere completata entro 2-3 giorni.
Introduzione
Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un modello animale potente per lo studio dello sviluppo dei vertebrati, la malattia, il comportamento, e in-droga screening di 1-3. Zebrafish embrioni possono essere ottenuti in gran numero da un singolo incrocio. Fecondazione e sviluppo si verifica ex utero e gli embrioni otticamente chiare sviluppano rapidamente. Eventi critici evolutivi si verificano durante le prime 48 ore dopo la fecondazione (HPF). Ciò include la comparsa di organo primordi e l'avvio di citodifferenziazione. Knockdown o sovra-espressione di proteine può essere raggiunto attraverso la microiniezione di embrioni con ant....
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Protocollo
1. Tutto il montaggio ibridazione in situ su embrioni di zebrafish
1.1 Preparazione di embrioni
- Raccogliere gli embrioni in fase di sviluppo necessari. Si prega di consultare Kimmel et al. 5 per la descrizione embrionale.
- Rimuovere chorions manualmente usando pinze (Dumont Orologiai forcipe no. 5).
- Fissare embrioni in una soluzione al 4% di paraformaldeide (PFA) costituito in PBS (Phosphate Buffered Saline) notte a 4 ° C.
- Lavare con PBS embrioni almeno 3x per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
- Conservare embrioni in 100% di metan....
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Risultati
Utilizzando il protocollo con 50 embrioni per cesto (per gene / per condizione sperimentale) il pattern di espressione di tale gene può essere ottenuto in un esperimento. Quasi tutti gli embrioni presentano profili di espressione simili per un gene particolare. Esempi rappresentativi di ibridazione in situ colorazione sono mostrati nelle Figure 3-6.
Sia il senso e anti-senso ribosonde stati sintetizzati dai cDNA corrispondenti a PC5.1 PC5.2, 6, 7, SCL/tal.......
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Discussione
Abbiamo sviluppato metodi migliori per visualizzare l'RNA con alta risoluzione. Il nelle procedure di ibridazione in situ sono effettuate utilizzando semplici cesti su misura con fondi porosi (Figura 1). Gli embrioni sono trattati con soluzioni RNase-free in piastre da 6 pozzetti a temperatura ambiente in condizioni sterili.
Per segregare gli embrioni cestini sono realizzati in diversi tubi colorati Eppendorf. Cestini con o senza cerchio vengono utilizz.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Taq Polimerasi | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA - Doppio promotore pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| Kit di purificazione del plasmide mini HQ | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Enzimi di restrizione Not1 e HindIII | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Fenolo saturo tampone, | Invitrogen | 15513039 | conservare a 4 °C. Occhi, pelle e vie respiratorie irritanti e sospetto cancerogeno. Prestare attenzione durante la manipolazione. |
| Cloroformio | Fisher | C607-1 | Tossico e sospetto cancerogeno. Lavorare sotto cappa aspirante. |
| DNAsi libera da RNasi I | Roche | 4716728001 | Preparare piccole aliquote e conservare a -20°C. |
| Miscela di marcatura DIG-RNA con RNA polimerasi Sp6, T7 e T3 | Roche | 11277073910 | |
| Inibitore della RNasi | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Acetato di sodio (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% etanolo | Alcoli commerciali Dietil | ||
| pirocarbonato (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | Il DEPC è un irritante per gli occhi, la pelle e le vie respiratorie. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Utilizzare occhiali di sicurezza, guanti e maschera. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0,5 M (pH 8,0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Sistemi per acquari | sale oceanico istantaneo | N/A | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Preparare e conservare a -20 gradi C come aliquote da 40 ml per un uso successivo. Il PFA è tossico. Utilizzare occhiali di sicurezza, guanti e maschera antipolvere. |
| Feniltiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC è altamente tossico. Utilizzare occhiali di sicurezza, guanti e maschera antipolvere. |
| Metanolo | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Orologiaio' s) Modello di pinza n. 5 | Fine Science Tools | ||
| Cluster di colture cellulari a sei pozzetti | Sarstedt | 83.1839 | |
| I cestelli sono realizzati in rete di nylon e provette Eppendorf | Preparazione | Per realizzare i cestelli, tagliare le provette Eppendorf (1,5 ml) con o senza bordi per rimuovere l'estremità conica. Tagliare la rete di nylon in piccoli pezzi corrispondenti alla dimensione di le estremità tagliate delle provette Eppendorf. Posizionare i tubi con la rete di nylon che copre l'estremità tagliata su un impianto elettrico. piastra riscaldante fino a quando sia il tubo che la rete di nylon non si uniscono (eseguire in cappa aspirante). Tagliare la rete in eccesso dai cestelli e conservarli in metanolo al 100% fino al momento dell'utilizzo. | |
| Poliossietilenesorbitano Monolaurato (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinasi K | Fermentas | EO0491 | |
| Anidride acetica | Sigma | 242845 | |
| Trietanolammina | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, grado di purezza | elevato Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resina | Bio Rad | 142-6424 | |
| Acido citrico monoidrato | Sigma | C0706-500G | |
| Eparina Sale sodico | Sigma | H3393-25KU | |
| Soluzione salina-Citrato di sodio Tampone (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA da lievito di birra tipo X Sigma | R5636-1ML | ||
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisolo cloridrato | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimetilformammide anidro (DMF) | Sigma | 227056 | Irritante, tossico, combustibile e sospetto teratogeno. Maneggiare con un abbigliamento di sicurezza adeguato, inclusi guanti e occhiali. |
| 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) | Sigma | N6639 | Proteggere questa soluzione dalla luce. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Proteggi questa soluzione dalla luce. |
| Albumina da siero bovino, frazione purificata V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Pecora Anti-digossigenina-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glicerolo | Sigma | G5516-500ML | |
| Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Sistemi di acquari | oceanici istantanei | N/A |
Riferimenti
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
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Ristampe e permessi
