Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

Sommario

Salvataggio di arenavirus ricombinanti da cDNA clonati, un approccio denominato invertire la genetica, permette ai ricercatori di indagare il ruolo di specifici prodotti genici virali, così come il contributo dei loro diversi domini e residui specifici, per diversi aspetti della biologia di arenavirus . Allo stesso modo, invertire tecniche di genetica in linee cellulari approvato dalla FDA (Vero) per lo sviluppo di vaccini fornisce nuove possibilità per la generazione di vaccini efficaci e sicuri per combattere arenavirus patogeni umani.

Abstract

Lo sviluppo e l'attuazione di arenavirus genetica inversa rappresenta un significativo passo avanti nel campo ⁴ arenavirus. L'uso di sistemi minigenome Arenavirus base di cellule insieme con la capacità di generare ricombinanti arenaviruses infettive con mutazioni predeterminate nei loro genomi ha facilitato l'indagine del contributo dei determinanti virali nelle diverse fasi del ciclo di vita arenavirus, così come virus-ospite interazioni e meccanismi di patogenesi arenavirus ^{1, 3, 11.} Inoltre, lo sviluppo di arenaviruses trisegmented ha permesso l'utilizzo del genoma arenavirus di esprimere ulteriori geni estranei di interesse, aprendo così la possibilità di applicazioni vettore di vaccino arenavirus basati ^5. Analogamente, lo sviluppo di ciclo unico arenaviruses infettivi capaci di esprimere geni reporter fornisce un nuovo strumento sperimentale per migliorare la sicurezza di ricerca che coinvolge highly patogeni arenavirus umani ^16. La generazione di arenavirus ricombinanti utilizzando tecniche di genetica inversa plasmide-based ha finora invocato l'uso di linee cellulari di roditori ^7,19, il che pone alcune barriere per lo sviluppo di Food and Drug Administration (FDA) con licenza vaccino o di vettori vaccinali. Per superare questo ostacolo, si descrive qui la generazione efficiente di arenavirus ricombinanti in cellule Vero approvato dalla FDA.

Introduzione

Arenavirus sono virus con involucro con bisegmented, negativo-stranded RNA del genoma ³ che appartengono alla famiglia Arenaviridae. Il genoma codifica arenavirus quattro proteine ​​in modo ambisense da due segmenti virali separati ^3. Il grande segmento (L) codifica per la RNA polimerasi RNA-dipendente (L) e il piccolo anello (davvero interessante nuovo gene) finger proteina (Z), che serve come il principale motore di virus in erba. Il piccolo (S) segmento codifica la nucleoproteina virale (NP) e la glicoproteina di superficie (GP) (Figura 1).

Diversi membri della famiglia Arenaviridae

Protocollo

1. Arenavirus Rescue Transfezione

Il nostro sistema di salvataggio si basa sull'utilizzo di due polimerasi II proteiche plasmidi di espressione codificanti la nucleoproteina (NP) e RNA-dipendente-RNA-polimerasi (L), i fattori trans-agenti virali necessarie per la replicazione dell'RNA e l'espressione genica del genoma arenavirus ^{7, 19,} e plasmidi capaci di dirigere la sintesi intracellulare, attraverso l'RNA cellulare polimerasi I (pol-I), del S e L antigenome specie di RNA ^7. Nei nostri studi usiamo l'espressione proteica pCAGGS plasmide, che utilizza il pollo promotore β-actina e polyadenylanation....

Risultati

Salvataggio di successo di un ricombinante arenavirus wild-type sarà confermata dalla presenza di antigeni virali mediante IFA (Figura 5). Nel caso dei virus ricombinanti trisegmented, salvataggio di successo virale può essere valutata osservando espressione GFP mediante microscopia a fluorescenza (Figura 6A). Salvataggio di successo sarà ulteriormente confermato dalla valutazione dell'espressione Gluc (Figura 6B). Rappresentante risultati illustrano il salvataggio .......

Discussione

Generazione di arenavirus ricombinanti utilizzando tecniche di genetica inversa plasmide-based è diventata un metodo ampiamente utilizzato per lo studio di molti e diversi aspetti della biologia arenavirus. Qui documentiamo un miglioramento fondamentale per l'attuale sistema eseguendo arenavirus salvataggi su cellule Vero, consentendo la potenziale generazione di candidati vaccini approvati dalla FDA contro arenavirus e vettori di vaccini contro altre malattie infettive.

Le procedure spe.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali e metodi
Le linee cellulari Vero E6 (cellule epiteliali renali di scimmia verde africana) sono mantenute in un 37 ° C con 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Le cellule sono disponibili presso l'American Type Culture Collection (ATCC, numero di catalogo CRL-1586). Plasmidi Tutti i plasmidi, ad eccezione di hpol-I L, possono essere coltivati a 37 ° gradi; C, per 16-18 ore. Si consiglia di coltivare colture di hpol-I L a 30 gradi C per 24 ore. I plasmidi vengono preparati utilizzando un maxi kit plasmidico (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) seguendo le raccomandazioni del produttore e conservati a -20 °C. La concentrazione del plasmide di DNA purificato è determinata mediante spettrofotometria a 260 nm, con la purezza stimata utilizzando il rapporto 260:280 nm. Le preparazioni con rapporti 1,8-2,0 260:280 nm sono considerate appropriate per il salvataggio dei virus. Inoltre, la concentrazione e la purezza del plasmide devono essere confermate con l'elettroforesi su gel di agarosio. Viruses Il protocollo descritto per il salvataggio di rLCMV (Armstrong 53b) e rCandid#1 può essere eseguito in condizioni di livello di biosicurezza (BSL) 2. Il materiale contaminato, compresi i TCS e le cellule, deve essere sterilizzato prima dello smaltimento. Il salvataggio di altri arenavirus può richiedere strutture BSL più elevate, quindi devono essere seguite adeguate misure di sicurezza. Terreni e soluzioni per colture tissutali DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml di terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM), 50 ml di siero fetale bovino (FBS) e 5 ml di penicillina/streptomicina 100X (PS). Conservare a 4 °C. Questo terreno verrà utilizzato per il mantenimento delle cellule Vero. Terreno infettivo: miscela 2 a 1 di OptiMEM e DMEM 10 %FBS 1 %PS. Conservare a 4 °C. Questo terreno verrà utilizzato durante le infezioni virali. 10X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 11,5 g di Na2HPO4.7H2O, 2 g di KH2PO4. Aggiungi ddH2O fino a 1 litro. Regolare il pH a 7,3. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente. 1X PBS: Diluire 10X PBS 1:10 con ddH2O. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente. 2,5 % BSA: 2,5 g di BSA in 97,5 ml di 1X PBS. Conservare a 4 °C. Questo viene utilizzato come soluzione di blocco per l'IFA.