Articolo metodologico

Microfabrication di Patterns Oro nanoporosi per Cell-materiali Interaction Studies

DOI:

10.3791/50678

⸱

15 luglio 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis , 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Davis , 3Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

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Segnaliamo su tecniche per micropattern nanoporosi film sottili di oro tramite la stampa stencil e fotolitografia, così come i metodi di cellule di coltura, su modelli di microfabbricati. Inoltre, si descrivono metodi di analisi di immagine per caratterizzare morfologia del materiale e le cellule in coltura mediante scansione elettronica e tecniche di microscopia a fluorescenza.

Abstract

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Materiali nanostrutturati con dimensioni caratteristiche di decine di nanometri hanno migliorato le prestazioni delle diverse tecnologie, tra cui le celle a combustibile, biosensori, rivestimenti dei dispositivi biomedicali e strumenti di consegna della droga. Oro nanoporous (np-Au), prodotto da un processo di auto-assemblaggio nano-scala, è un materiale relativamente nuovo che presenta un'ampia area superficiale effettiva, elevata conducibilità elettrica, e l'attività catalitica. Queste proprietà hanno reso np-Au un materiale interessante per la comunità scientifica. Maggior parte degli studi su NP-Au impiegano campioni macro scala e concentrarsi sulla scienza fondamentale della materia e delle sue applicazioni catalitiche e sensore. Gli esemplari macro scala limitano il potenziale di NP-Au in sistemi miniaturizzati, inclusi i dispositivi biomedici. Al fine di risolvere questi problemi, abbiamo inizialmente descriviamo due metodi diversi per micropattern np-Au film sottili su substrati rigidi. Il primo metodo utilizza mascherine stencil manualmente-prodotti per la creazione di millimetro scala modelli NP-Au, while il secondo metodo utilizza decollo fotolitografia per modelli modello sub-millimetrica scala. Come i film sottili np-Au sono ottenute tramite il processo sputtering-deposizione, che siano compatibili con le tecniche convenzionali di microfabbricazione, quindi suscettibili di integrazione facile in microsistemi. Questi sistemi includono elettricamente indirizzabili piattaforme biosensore che beneficiano di elevata superficie effettiva superficie, conducibilità elettrica, e l'oro-tiolo-based bioconjugation superficie. Descriviamo coltura cellulare, immunostaining, e le tecniche di elaborazione di immagini per quantificare l'interazione del np-Au con cellule di mammifero, che è un parametro importante per alcune prestazioni biosensori. Ci aspettiamo che le tecniche qui illustrate dovranno favorire l'integrazione delle np-Au in piattaforme a diverse scale di lunghezza e in numerose applicazioni, tra cui biosensori, sistemi di stoccaggio di energia, e catalizzatori.

Introduzione

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Materiali con caratteristiche nano-scala hanno mostrato risultati promettenti nel migliorare diverse applicazioni, tra cui le celle a combustibile 1 Sensori, 2,3 E dispositivi biomedicali 4,5. Un materiale relativamente nuovo è oro nanoporous (np-Au), che è prodotto da un processo di auto-assemblaggio nanoscala. Il precursore di np-Au è una lega d'oro che più comunemente è costituito da argento al 60% a 80% in percentuale atomica. Brevemente, la caratteristica nanostruttura poro aperto è il risultato di riarrangiamento di atomi di oro in cluster come argento viene sciolto con un acido forte ( Esempio Acido nitrico 70%) o sotto un potenziale elettrochimico 6-8. Np-Au benefici da vari attributi desiderabili, tra cui ampia superficie effettiva, elevata conducibilità elettrica, ben consolidate tecniche di funzionalizzazione superficiale, e biocompatibilità 9. Anche se vi è stata una rapida espansione di studi su np-Au, la maggior parte di loro concentrarsi sulle proprietà meccaniche di np-Au 10,11, Attività catalitica 12, E biomolecolare prestazioni di rilevamento 13-15. Mentre gli attributi desiderabili sono molto utili per diversi strumenti biomedici 16,17, Le applicazioni in questo settore sono stati limitati. Una possibile ragione per questo è che la maggior parte degli studi si sono prevalentemente utilizzati campioni macro-scala ( Esempio Film, lastre, lingotti) e le tecniche per incorporare np-Au in sistemi miniaturizzati sono rimasti inadeguati. In realtà ci sono solo una manciata di esempi di utilizzo di tecniche di microfabbricazione convenzionali che impiegano film np-Au 16-20. Con l'avvento della tecnologia miniaturizzazione e la necessità di nuovi strumenti biomedici, è diventato cruciale per poter integrare nuovi materiali nelle apparecchiature. Ciò richiede tipicamente che i materiali possono essere depositati e modellati con tecniche convenzionali di microfabbricazione. Inoltre, la rapida quantificazione delle interazioni cellula-materiale è comunemente necessario valutare la biocompatibilità di un nuovo materiale. L'obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare le tecniche di base per micropattern np-Au film e quantificare sia nanostruttura e le interazioni cellula-materiale tramite l'elaborazione di immagini digitali.

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Protocollo

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1. Nanoporoso Oro Fabrication

  1. Substrati puliti in soluzione Piranha
    1. Aggiungere 25 ml di perossido di idrogeno (30%) di acido solforico 100 ml (96%) in un piatto di cristallizzazione e scaldare la miscela a 65 ° C su una piastra. ATTENZIONE: I liquidi sono estremamente corrosivi e devono essere maneggiati con cura. La soluzione esausta non deve essere conservata in un contenitore sigillato, come può esplodere.
    2. Luogo di 1 pollice da vetrini da 3 pollici nella miscela con pinze resistenti agli acidi e quindi ripulirli per 10 min. Utilizzare una barca immunoistochimica porcellana per batch pulizia piccole lamelle. Trattare piccole coprioggetto con plasma ad aria a 10 W per 30 secondi prima di immergerlo nella soluzione.
    3. Sciacquare i campioni puliti in piatti di cristallizzazione sotto corrente (DI) di acqua deionizzata per 3 min. Campioni in piega con una pistola di azoto oltre privi di pelucchi asciugamani.
  2. Preparare maschera stencil (Metodo 1: utilizzare questa per la creazione di modelli di millimetro scala)
    1. Punch 250 micron di spessore lastre in elastomero di silicone con biopsia pugni e / o incidere fuori regioni con un bisturi su una superficie di plastica semi-dura. Pulire le lastre in elastomero trasformati in 70% di isopropanolo e asciugare con pistola azoto.
    2. Posizionare il foglio perforato su una sfilacciato asciugamano camera bianca e allineare i coprioggetti piranha-puliti sopra lo stencil con la superficie del campione verso lo stencil.
  3. Modello lift-off photoresist (Metodo 2: utilizzare questo per creare pattern sub-millimetrica scala)
    1. Posizionare un piranha-pulito vetrino da microscopio a girare Chuck e soffiare via le particelle con la pistola di azoto. Pipettare 1,5 ml di promotore di adesione (esametildisilazano) sul vetrino utilizzando una pipetta di plastica. Stendere il promotore facendo girare la slitta successivamente a 500 rpm per 5 sec e 1.500 rpm per 30 sec. Cuocere il vetrino su una piastra riscaldante a 115 ° C per 7 minuti e lasciate raffreddare per 5 minuti.
    2. Dispensare 4 ml di photoresist sul vetrino (3 pollici by 1 pollice). Stendere il photoresist facendo girare la diapositiva con lo stesso protocollo per il promotore di adesione. Cuocere il photoresist su una piastra riscaldante a 115 ° C per 1,5 minuti e lasciate raffreddare per 10 minuti.
    3. Esporre il photoresist vetrino rivestito con luce UV (intensità: 22 mW / cm 2) attraverso una maschera di trasparenza per 15 sec. Cuocere il fotoresist su una piastra riscaldante a 115 ° C per 1,5 minuti e attendere 45 min. Sciogliere il photoresist esposto nel sviluppatore per almeno 3,5 min. Sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata. Ispezionare i modelli sviluppati sotto un microscopio ottico.
  4. Deposito metalli precursori per la produzione di film sottili np-Au
    1. Caricare i campioni in una macchina di sputtering che può depositare autonomamente oro, argento e cromo. Deposito a pulire i campioni per 90 sec a 50 W con 25 mTorr argon atmosfera di elaborazione prima di iniziare la deposizione di metallo.
    2. Sputtering cromo per 10 minuti a 300 W fino a 10 anni mTorr argon. Polverizzazione catodica oro per 90 secondi a 400 W ONUder 10 mTorr argon. Co-sputtering oro e d'argento per 10 minuti con l'argento a 200 W e di potenza Au a 100 W. Spegnere oro polverizzazione catodica fonte di circa 10 secondi prima di spegnere l'argento sputtering fonte.
  5. Ottenere microdisegnature metallici precursori
    1. Sonicare campioni photoresist rivestite in ~ 180 ml di spogliarellista photoresist per 10 cicli di 20 sec sonicazione e 2 minuti di pausa tra i cicli. Lavare i campioni con acqua deionizzata e asciugare con una pistola di azoto. Ispezionare i modelli in metallo sotto un microscopio.
    2. Sbucciate lo stencil elastomero da campioni rivestiti non photoresist con due pinzette per rivelare il metallo depositato.
  6. Dealloy precursore metallico e modificare nanostruttura tramite trattamento termico
    1. Riempire un bicchiere di vetro da 200 ml con 170 ml di acido nitrico (70%) e mantenere la temperatura della soluzione a 55 ° C su una piastra. ATTENZIONE: L'acido nitrico è estremamente corrosivo e deve essere maneggiato con equipaggiamento protettivo.
    2. Trattare piccole coprioggetto con plasma ad aria a 10 W per 30 secondi prima di immersione in acido nitrico. Luogo di 1 pollice da vetrini da 3 pollici nel bicchiere con pinze resistenti agli acidi e dealloy loro per 15 min. Utilizzare una barca immunoistochimica porcellana per batch dealloying piccole lamelle.
    3. Sciacquare i campioni dealloyed da successivamente immergendole in due bicchieri pieni di acqua DI fresca tre volte. Conservare i campioni in acqua deionizzata e sostituire l'acqua con acqua DI fresca ogni giorno per almeno una settimana. Campioni in piega con una pistola di azoto oltre asciugamani filacciosi prima dell'uso.
    4. Caricare campioni su un wafer di silicio pulita in un rapido apparecchiature per il trattamento termico. Regolare la temperatura tra 200 ° C e 450 ° C e la velocità di rampa di 10 ° C / sec. Esporre i campioni alla temperatura prescritta per 10 min sotto azoto ambiente. Lasciare la camera di fresco (<100 ° C) e rimuovere i campioni. In alternativa, inserire lentamente i campioni sulla piastra per il trattam termicoent.

2. Colture Cellulari

  1. Preparare i campioni np-Au per la coltura cellulare
    1. Luogo np-Au campioni in piatti di polistirolo e il trattamento con plasma ad aria a 10 W per 30 sec e trasferire i campioni di piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti.
    2. Aggiungere 500 microlitri mezzi di coltura completi (Modified Eagle Medium di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptomicina) in ciascun pozzetto. Conservare in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2 fino semina delle cellule (<1 ora).
  2. Mantenere, di passaggio, e di semi di cellule
    1. Mantenere le cellule di interesse (in questo caso 3T3-NIH fibroblasti o astrociti murini) a T75 palloni con terreni di coltura e di passaggio quando le cellule sono il 70% confluenti.
    2. Per passaging le cellule, rimuovere i supporti dal pallone, lavare due volte con 10 ml di tampone fosfato (PBS), aggiungere 2 ml di 1x tripsina / EDTA e incubare fino a quando il distacco delle cellule (~ 5 min). Aggiungere 3 ml di mezzi freschi ecentrifugare a 1200 rpm per 3 min. Aspirare il surnatante e sospendere il pellet in 2 mezzi ml.
    3. Rimuovere il supporto spesi dai pozzetti e seme le cellule sulla vetrini ad una densità di 25.000 cellule / cm 2 con un volume finale di 1 ml. Agitare la piastra di coltura avanti-indietro e destra-sinistra per garantire un rivestimento uniforme delle cellule sugli esemplari. Incubare le cellule fino al momento dell'analisi durante il controllo quotidiano.

3. Cellulare e Analisi Materiale

  1. Colorare le cellule di visualizzare citoscheletro e nuclei
    1. Rimuovere i supporti spesi dai pozzetti e lavare le cellule due volte con PBS. Fissare le cellule in paraformaldeide 4% in PBS per 15 min.
    2. Preparare la soluzione di colorazione 300 nM Alexa Fluor 488 phalloidin in PBS con 1% di albumina di siero bovino.
    3. Lavare le cellule due volte con PBS, e li permeabilize in 500 microlitri 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min.
    4. Lavare le cellule due volte con PBS e trasferirli da pulire pozzetti. Blot 50 - 200 ml soluzione di colorazione sui campioni e conservare al buio per 20 min.
    5. Lavare le cellule con PBS e contro-macchia con 3 Nm di DAPI in PBS per 5 min.
    6. Lavare le cellule con PBS, e tuffo in acqua deionizzata prima di montare su vetrini di copertura in vetro con supporti di montaggio e sigillare con smalto trasparente.
  2. Acquisire immagini di campioni np-Au e colture cellulari su superfici np-Au
    1. Superfici Immagine np-Au con microscopio elettronico a scansione (SEM) con 50.000 X ingrandimento a 10 kV elettrone energia utilizzando rivelatore di elettroni secondari.
    2. Cattura immagini cellulari composite in punti diversi i campioni utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con ingrandimento 10X con i cubetti di filtro appropriate.
  3. Le immagini del processo per determinare la morfologia dei pori e delle cellule
    1. Aprire le immagini in ImageJ e suddivisa in singoli canali se applicabile. Convertire le immagini a 8-bit, sottrarre il fondo, e lisciare loro dai filtri d'medianang. Regolare la soglia manualmente o con built-in di soglia algoritmi per evidenziare i pori (vuoti) e corpi cellulari / nuclei.
    2. Utilizzare il comando spartiacque per separare i pori unite o cellule. Impostare i parametri di analisi delle particelle ed eseguire il comando per estrarre il numero di particelle, area media, e la copertura per cento di particelle. Usare le immagini di cellule DAPI macchiati per il conteggio delle cellule e le immagini di cellule falloidina macchiati per quantificare copertura cellulare per cento.
    3. Modificare i file di macro inclusi per eseguire analisi in batch di immagini multiple.

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Risultati

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La figura 1 illustra le principali fasi procedurali, tra cui la creazione dei modelli NP-Au, coltura delle cellule, quantificando la nanostruttura, e la caratterizzazione morfologie cellulari. Lo stencil elastomero mostrato in Figura 2a (in alto) è utilizzato per la creazione dei modelli NP-Au mostrati nelle immagini sottostanti. Figura 2b è una fotografia della barca in porcellana per i campioni di elaborazione batch. Figura 2c mostra il cambiamento di...

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Discussione

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Dimostriamo due tecniche diverse per micropattern np-Au film per espandere l'uso di questi film in microsistemi e studi biologici. Deposito a spruzzo oro e argento è un metodo versatile per creare modelli np-Au, come sputtering è compatibile con i processi convenzionali di microfabbricazione e la composizione della lega e lo spessore può essere facilmente controllato variando i poteri individuali pistola sputtering (per obiettivi d'oro e d'argento) e il tempo di deposizione rispettivamente. Tipico film di np...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno alcun interesse finanziario in conflitto.

Ringraziamenti

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O. Kurtulus e D. Dimlioglu sono supportati da una Università della California Laboratorio Commissioni Research Award Program 12-LR-237197. P. Daggumati è supportato da una University of California Davis Research Investimenti in Scienze e Ingegneria (RISE) Award. CA Chapman è supportato da un Dipartimento di istruzione universitaria di Assistenza Aree di Fellowship bisogno nazionale. Questo lavoro è stato sostenuto da UC Lab Commissioni Programma di ricerca, UC Davis RISE, e UC Davis College of Engineering di start-up fondi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bersaglio d'oroLeskerEJTAUXX403A2Precursore della lega per la produzione di np-Au
Bersaglio cromatoLeskerEJTCRXX353A2Strato adesivo
Bersaglio d'argentoLeskerEJTAGXX403A2Precursore della lega per la produzione di np-Au
Barca in porcellanaThomas Scientific8542E40Utilizzato per la lavorazione di piccoli campioni
Acido nitricoSigma-Aldrich43873Utilizzato al 70% per la delega
dell'acido solforicoJ.T Baker7664-93-9Utilizzato al 96% per la pulizia dei piranha
Perossido di idrogenoJ.T Baker7722-84-1Utilizzato al 30% per la pulizia dei piranha
Punzoni per biopsiaTed Pella150xxDisponibile in diverse dimensioni
Fogli di elastomero siliconicoRogers CorporationHT 6240Disponibile in diversi spessori
EsametildisilazanoSigma-Aldrich440191-100MLUtilizzato come promotore di adesione per resist positivo
Microposit MF CD26Shipley38490Rivelatore di fotoresist positivo
PRS 3000J.T BakerJT6403-5Stripper fotoresist
positivo Vetrini coprioggetti circolari (12 mm)Ted Pella26023Utilizzato come substrato per modelli metallici e colture cellulari
Vetrini (1 x 3 pollici)Ted Pella26007Utilizzato come substrato per modelli metallici
Nastro in poliimmide KaptonVWR82030-950Utilizzato per il fissaggio di elastomeri
Maschere di trasparenzaOutput CityUtilizzato in fotolitografia http://www.outputcity.com/
Pulitore al plasmaHarrick PlasmaPDC-32GUtilizzato per l'attivazione di superfici in vetro
Macchina per lo sputteringKurt J. LeskerLAB18Utilizzato per il deposito di metalli

Riferimenti

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