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La microscopia a super risoluzione basata sulla localizzazione può essere applicata per ottenere una mappa spaziale (immagine) della distribuzione di singole molecole marcate in fluorescenza all'interno di un campione con una risoluzione spaziale di decine di nanometri. Utilizzando proteine fluorescenti fotoattivabili (PAFP) o fotocommutabili (PSFP) fuse a proteine di interesse, o coloranti organici coniugati ad anticorpi o altre molecole di interesse, la microscopia di localizzazione della fotoattivazione della fluorescenza (FPALM) può visualizzare simultaneamente più specie di molecole all'interno di singole cellule. Utilizzando il seguente approccio, popolazioni di grandi numeri (da migliaia a centinaia di migliaia) di singole molecole vengono visualizzate in singole cellule e localizzate con una precisione di ~10-30 nm. I dati ottenuti possono essere applicati alla comprensione delle distribuzioni spaziali su scala nanometrica di più tipi di proteine all'interno di una cellula. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è il notevole aumento della risoluzione spaziale: mentre la diffrazione limita la risoluzione a ~200-250 nm nella microscopia ottica convenzionale, FPALM può visualizzare scale di lunghezza più piccole di un ordine di grandezza. Poiché molte ipotesi biologiche riguardano le relazioni spaziali tra diverse biomolecole, la migliore risoluzione di FPALM può fornire informazioni su questioni di organizzazione cellulare che in precedenza erano inaccessibili alla microscopia a fluorescenza convenzionale. Oltre a descrivere in dettaglio i metodi per la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati, descriviamo qui la configurazione ottica per FPALM. Un'ulteriore considerazione per i ricercatori che desiderano eseguire la microscopia a super-risoluzione è il costo: le configurazioni interne sono significativamente più economiche della maggior parte delle macchine di imaging disponibili in commercio. I limiti di questa tecnica includono la necessità di ottimizzare l'etichettatura delle molecole di interesse all'interno dei campioni cellulari e la necessità di software di post-elaborazione per visualizzare i risultati. Descriviamo qui l'uso di PAFP e dell'espressione di PSFP per visualizzare due specie proteiche in cellule fissate. Viene anche descritta l'estensione della tecnica alle cellule viventi.