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Articolo metodologico

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

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DOI:

10.3791/50680

⸱

9 dicembre 2013

 ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Maine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Abstract

La microscopia a super risoluzione basata sulla localizzazione può essere applicata per ottenere una mappa spaziale (immagine) della distribuzione di singole molecole marcate in fluorescenza all'interno di un campione con una risoluzione spaziale di decine di nanometri. Utilizzando proteine fluorescenti fotoattivabili (PAFP) o fotocommutabili (PSFP) fuse a proteine di interesse, o coloranti organici coniugati ad anticorpi o altre molecole di interesse, la microscopia di localizzazione della fotoattivazione della fluorescenza (FPALM) può visualizzare simultaneamente più specie di molecole all'interno di singole cellule. Utilizzando il seguente approccio, popolazioni di grandi numeri (da migliaia a centinaia di migliaia) di singole molecole vengono visualizzate in singole cellule e localizzate con una precisione di ~10-30 nm. I dati ottenuti possono essere applicati alla comprensione delle distribuzioni spaziali su scala nanometrica di più tipi di proteine all'interno di una cellula. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è il notevole aumento della risoluzione spaziale: mentre la diffrazione limita la risoluzione a ~200-250 nm nella microscopia ottica convenzionale, FPALM può visualizzare scale di lunghezza più piccole di un ordine di grandezza. Poiché molte ipotesi biologiche riguardano le relazioni spaziali tra diverse biomolecole, la migliore risoluzione di FPALM può fornire informazioni su questioni di organizzazione cellulare che in precedenza erano inaccessibili alla microscopia a fluorescenza convenzionale. Oltre a descrivere in dettaglio i metodi per la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati, descriviamo qui la configurazione ottica per FPALM. Un'ulteriore considerazione per i ricercatori che desiderano eseguire la microscopia a super-risoluzione è il costo: le configurazioni interne sono significativamente più economiche della maggior parte delle macchine di imaging disponibili in commercio. I limiti di questa tecnica includono la necessità di ottimizzare l'etichettatura delle molecole di interesse all'interno dei campioni cellulari e la necessità di software di post-elaborazione per visualizzare i risultati. Descriviamo qui l'uso di PAFP e dell'espressione di PSFP per visualizzare due specie proteiche in cellule fissate. Viene anche descritta l'estensione della tecnica alle cellule viventi.

Introduzione

Sebbene esistano strutture cellulari su un'ampia gamma di scale spaziali, l'imaging a fluorescenza dell'organizzazione cellulare su scale di lunghezza inferiori a ~250 nm è limitato nella microscopia convenzionale a causa del vincolo fisico del limite di diffrazione. Questo limite è stato superato con l'avvento della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM1) e tecniche simili2,3, in grado di localizzare un gran numero di singole molecole con precisione di ~10 nm, per generare immagini con risoluzione di poche decine di nanometri. FPALM si basa sull'utilizzo del controllo ottico per attivare e inattivare sottoinsiemi di molecole (per una descrizione completa di FPALM e istruzioni su come implementare questo sistema di imaging, vedi Gould et al.4). Questa tecnica consente di mappare le distribuzioni spaziali di intere popolazioni di singole molecole, chiarendo così le strutture biologiche su scale di lunghezza che vanno da decine di nanometri a decine di micron. La microscopia a super-risoluzione basata sulla localizzazione (di seguito denominata microscopia di localizzazione) è stata ora adattata per affrontare una serie di questioni biologiche, con sviluppi tecnologici che permettono, ad esempio, l'imaging di singoli orientamenti molecolari con polarizzazione FPALM, o P-FPALM5, l'imaging a fluorescenza di singole molecole in tre dimensioni con Biplane FPALM6 o altre tecniche7-9e l'imaging a fluorescenza a super-risoluzione di singole molecole in cellule viventi10-12. La microscopia di localizzazione è stata applicata anche all'imaging di più specie in cellule fissate13-16. Recentemente, tre specie proteiche sono state visualizzate simultaneamente con FPALM sia in cellule fisse che in cellule viventi17. La microscopia di localizzazione può visualizzare campioni marcati in vari modi: gli esempi includono proteine espresse con tag di fusione PAFP o PSFP, anticorpi o molecole marcate con coloranti organici in gabbia o coloranti organici convenzionali. Mentre l'uso di coloranti fluorescenti convenzionali consente la marcatura delle proteine in assenza di un tag di proteina di fusione, le condizioni generalmente richieste per l'uso di coloranti organici non in gabbia nell'imaging a super-risoluzione richiedono che i campioni siano immersi in tamponi riducenti2. Inoltre, la somministrazione intracellulare di coniugati anticorpo-colorante richiede tipicamente che le cellule siano fissate e le loro membrane permeabilizzate, o richiede che le cellule viventi siano rese permeabili attraverso l'elettroporazione o altri mezzi. I requisiti per la riduzione delle condizioni tampone e la permeabilizzazione della membrana limitano l'idoneità dei coloranti organici per l'imaging di cellule vive, sebbene i recenti sviluppi abbiano consentito un uso efficace di HaloTag e FPALM per l'imaging delle strutture di membrana18.

FPALM è stata la prima tecnica di microscopia di localizzazione ad essere applicata alle cellule vive10. Nelle cellule vive, oltre a fornire una mappa spaziale dipendente dal tempo delle posizioni delle molecole marcate, FPALM può tracciare singole molecole su più fotogrammi e traiettorie molecolari determinate su scale temporali dimillisecondi 19. Pertanto, FPALM fornisce l'accesso a scale temporali abbastanza brevi e risoluzione su scala nanometrica.

Multicolor FPALM può essere utilizzato per una varietà di sonde diverse, comprese proteine fotoattivabili e coloranti organici in gabbia o non in gabbia. Forniamo qui dettagli sul protocollo e sulla configurazione per l'imaging simultaneo di due specie proteiche fluorescenti, Dendra2 e PAmCherry. Riportiamo i risultati dell'imaging PAmCherry coniugato a beta actina (PAmCherry-actin) e Dendra2 coniugato a emoagglutinina influenzale (Dendra2-HA) in fibroblasti NIH-3T3. I componenti descritti nella configurazione possono essere sostituiti con altro hardware più adatto all'imaging di altre sonde. In questo caso, abbiamo cercato di essere espliciti nel testo.

Multicolor FPALM è ideale per riportare le distribuzioni spaziali di più specie proteiche in cellule viventi o fisse. Questa tecnica è particolarmente adatta per studiare relazioni spaziali e/o dinamiche su scale spaziali di lunghezza nanometrica, anche se le immagini riporteranno la localizzazione su una gamma di scale di lunghezza, da decine di nanometri fino a decine di micron. Uno dei principali vantaggi di FPALM multicolore è che la configurazione è relativamente economica da costruire e molto flessibile per l'uso con varie combinazioni di sonde. Il processo di costruzione e calibrazione del sistema a partire dai componenti fornisce anche una notevole comprensione dei fattori che possono compromettere la qualità e l'interpretabilità dei dati, e quindi l'esito della ricerca. Qui descriviamo in dettaglio i metodi per la configurazione ottica, la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati di più specie proteiche, con costrutti di fusione PSFP e PAFP, utilizzando FPALM. Sebbene questo protocollo descriva l'analisi delle cellule fissate, queste procedure sono facilmente applicabili all'imaging delle cellule viventi.

La configurazione ottica qui descritta è ideale per l'imaging simultaneo del PSFP Dendra2 e del PAmCherry PAFP. Molte altre sonde possono essere utilizzate per l'imaging multicolore; Tuttavia, i componenti precisi richiesti possono variare, a seconda degli spettri di eccitazione ed emissione delle sonde scelte. Le scelte degli specchi dicroici, dei filtri e delle lunghezze d'onda del laser dovrebbero essere fatte sulla base di queste considerazioni.

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Protocollo

Nota: una rappresentazione schematica dei componenti ottici a cui si fa riferimento in questo protocollo può essere trovata nella Figura 1.

1. Preparazione del Campione di Cellule

  1. Piastre di celle a una densità ottimizzata (per le celle NIH-3T3, questa è di circa 2-5 x 104 cellule/cm2) in pozzetti di una camera a 8 pozzetti. Le cellule devono essere piastrate in terreni completi e adeguati al tipo di cellula, anche se i terreni devono essere prodotti senza antibiotici e senza rosso fenolo, che contribuisce alla fluorescenza di fondo. Si noti che le condizioni per la sperimentazione cellulare, come l'intervallo ottimale di numeri di passaggio, possono differire per le singole linee cellulari.
  2. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2 (o a condizioni appropriate per il tipo di cellula) per consentire alle cellule di aderire al vetrino. Trasfettare le cellule con DNA libero da endotossine per ciascuno dei due costrutti di specie proteiche (in questo caso, DNA per PAmCherry-actina e Dendra2-HA). Coprire il campione con materiale impermeabile alla luce come un foglio di alluminio. La trasfezione dovrebbe includere pozzetti con entrambi i costrutti di DNA e pozzetti con solo uno di ciascuno di questi costrutti.
  3. Incubare per 4-6 ore, 37 °C e 5% di CO2 (o in condizioni appropriate per il tipo di cellula), prima di passare a un terreno completo (con antibiotici, senza rosso fenolo) e incubare ulteriormente per 16-48 ore per consentire alle cellule di esprimere le proteine desiderate.
    1. Le cellule possono essere fissate lavando tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi incubare con paraformaldeide (PFA) al 4% (ATTENZIONE: tossico) in PBS per 15 minuti a RT e quindi lavare altre 3 volte con PBS. Tuttavia, a seconda delle proteine di interesse, questa fissazione può portare a un considerevole pool di molecole marcate che sono ancora mobili. Per ridurre ulteriormente la mobilità, i metodi di fissazione alternativi includono l'uso di metanolo refrigerato al 100% o allo 0,2% di gluteraldeide e al 4% di PFA in PBS per >30 minuti a 25 °C20. In entrambi i metodi, le cellule devono essere lavate con PBS come sopra. Si noti che l'uso di gluteraldeide può aumentare la fluorescenza di fondo o l'autofluorescenza in alcune condizioni di imaging e può richiedere un trattamento post-fissazione con boroidruro di sodio21.
  4. Il campione può essere conservato a 4 °C, immerso in PBS, sigillato in una pellicola autosigillante, per un massimo di 7 giorni prima dell'imaging.

2. Allineamento del microscopio

  1. Posizionare una scala di calibrazione (reticolo) sul tavolino del microscopio. Utilizzando un obiettivo 10X e la lampada per la luce trasmessa, centrare il reticolo al centro del campo visivo (FOV).
  2. Illuminazione Köhler. Regolare il microscopio per l'illuminazione di Köhler22. Per iniziare, chiudere l'apertura di campo e guardare attraverso gli oculari mettere a fuoco il reticolo. Se i bordi dell'apertura di campo non sono a fuoco, regolare l'altezza del condensatore fino a quando sia l'apertura di campo che il reticolo sono a fuoco.
  3. Regolare la posizione laterale dell'apertura di campo fino a quando non è centrata rispetto al campo visivo. Chiudere l'apertura del campo fino a quando non si illumina solo la griglia centrale sul reticolo.
  4. Per un allineamento approssimativo della posizione della fotocamera (cioè la prima volta che la configurazione viene allineata), utilizzare un'elevata intensità della lampada con l'otturatore della fotocamera CHIUSO e non posizionare alcun componente nella scatola B (Figura 1), nel percorso ottico fino a quando non viene raggiunto il passaggio 2.5. Non posizionare L2 e L3 nel percorso di rilevamento quando si allinea la telecamera per la prima volta. Centrare approssimativamente l'immagine del reticolo sull'otturatore della fotocamera regolando la posizione verticale e orizzontale della fotocamera (Figura 2B). Disabilita il guadagno EM, spegni le luci della stanza e apri l'otturatore della fotocamera.
  5. Dopo aver ridotto l'intensità della lampada a un livello che non danneggi il sensore della fotocamera, proiettare la luce dall'immagine del reticolo direttamente sul sensore della fotocamera (Figura 2A). Mettere a fuoco il reticolo regolando la manopola di messa a fuoco del microscopio durante la visualizzazione dell'immagine in modalità video live all'interno del software di acquisizione. Centrare l'immagine del reticolo sul sensore della fotocamera regolando la posizione verticale e orizzontale della fotocamera (Figura 2B).
  6. Posizionare L2 e L3 nel percorso di rilevamento tra l'apertura e la fotocamera (Figura 2C). Allineare L2 e L3, in modo che L2 sia a una lunghezza focale dal punto focale della porta di uscita del microscopio e L3 sia a una lunghezza focale dal sensore della fotocamera. La distanza tra L2 e L3 dovrebbe idealmente essere uguale alla somma delle lunghezze focali di L2 e L3, ma può essere regolata in qualche modo per adattarsi ai vincoli di spazio. La fotocamera e gli obiettivi devono essere alla stessa altezza della porta di uscita.
  7. Si noti che la luce emessa dal microscopio deve essere centrata su L2 e L3. Regolare la distanza tra L2 e il microscopio per assicurarsi che l'immagine del reticolo sia nitidamente a fuoco sia sulla fotocamera che attraverso gli oculari.
  8. Se necessario, è possibile utilizzare piccole traslazioni (ad es. <1 mm) di L2 e L3 per centrare l'immagine del reticolo sul sensore della fotocamera.
  9. Modulo a due colori. Una volta ottimizzata la posizione della telecamera, fissare i componenti mostrati nel riquadro B (Figura 1) nel percorso di rilevamento. Questi componenti possono essere fissati a un supporto rimovibile, in modo che l'intero modulo possa essere inserito per FPALM multicolore, o rimosso per altre applicazioni FPALM che non lo richiedono.
  10. La prima volta che questi componenti vengono assemblati, regolare la lunghezza del percorso di ciascun canale in modo che sia uguale. Proiettare il reticolo sul chip della fotocamera, regolare M7 e M9 e/o chiudere l'apertura di rilevamento (AP) per evitare la sovrapposizione spaziale tra i due canali. Mettere a fuoco l'immagine del reticolo nel canale della luce riflessa.
  11. Se l'immagine nel canale della luce trasmessa non è a fuoco, traslare M9 (e ruotare se necessario) fino a quando l'immagine del reticolo è a fuoco contemporaneamente in entrambi i canali. Si noti che i due canali devono essere spostati lateralmente l'uno dall'altro (Figura 2D). Questo spostamento, sia orizzontale che verticale, può influire sulla velocità di acquisizione. Per ulteriori informazioni, consultare il manuale d'uso della fotocamera.
  12. Registrare un'istantanea della scala del reticolo (da utilizzare successivamente nel calcolo dell'ingrandimento complessivo). Utilizzando il software della fotocamera, selezionare la regione di interesse desiderata. Frame rate più elevati saranno generalmente possibili per una regione di interesse più piccola.

3. Allineamento laser

  1. Accendere i laser di lettura e attivazione. (ATTENZIONE: i laser devono essere utilizzati solo dopo che gli operatori hanno seguito una formazione sulla sicurezza laser.) Tutte le porte del laboratorio devono rimanere chiuse, con solo il personale essenziale addestrato all'interno del laboratorio mentre i laser vengono allineati. Utilizzare gli otturatori SH1 e SH2 per bloccare rispettivamente i raggi di lettura e attivazione quando non sono in uso e i filtri ND per attenuare le potenze del laser a livelli di sicurezza (<1 mW). È utile ridurre al minimo l'illuminazione di tutta la stanza durante l'allineamento, ad eccezione dell'illuminazione necessaria per la sicurezza.
  2. Bloccare i raggi di attivazione e di lettura. Rimuovere L1 dal percorso del laser.
  3. Posiziona una carta bianca a filo contro M4. La maggior parte dei microscopi composti commerciali è dotata di un otturatore incorporato per bloccare l'illuminazione in entrata. Se disponibile, aprire l'otturatore del microscopio e mettere a fuoco fino a quando l'immagine del reticolo non viene proiettata su M4. Se non è disponibile un otturatore interno del microscopio, utilizzare un otturatore esterno in una posizione comoda che impedisca a tutti i raggi laser di entrare nel microscopio.
  4. Laser di lettura di centraggio nel campo visivo. Sbloccare la trave di lettura. Centrare il raggio di lettura sul mirino dell'immagine del reticolo su M4 regolando M1.
  5. Proiettare l'immagine del reticolo su M5 e regolare lo specchio M4 fino a quando il raggio non è centrato sul mirino dell'immagine su M5, in modo tale che il raggio di lettura sia centrato con il mirino del reticolo sia su M4 che su M5. Bloccare la trave di lettura.
  6. Laser di attivazione di centraggio nel campo visivo. Proiettare l'immagine del reticolo su M3 e rimuovere l'espansore del raggio (BE) dal percorso del laser. Sblocca il raggio di attivazione.
  7. Regolare M2 per centrare il raggio di attivazione sul mirino dell'immagine del reticolo su M3. Una volta centrato, sostituire il BE tra M2 e M3 e regolare la posizione del BE fino a quando il raggio non è centrato sul mirino dell'immagine del reticolo su M3.
  8. Utilizzando un obiettivo 10X, proiettare l'immagine del reticolo su M5, regolando la manopola di messa a fuoco del microscopio se necessario per ottenere la messa a fuoco. Regolare l'angolo di DM1 fino a quando il raggio di attivazione non è centrato sull'immagine del reticolo. Bloccare entrambe le travi.
  9. Senza obiettivo in posizione e con l'otturatore del microscopio aperto, proietta il laser di lettura attraverso l'apertura posteriore del microscopio. (ATTENZIONE: questo passaggio crea un pericolo per la sicurezza del laser dirigendo un raggio laser parallelo in un percorso verticale non bloccato.) Regolare M5 fino a quando il raggio non esce direttamente dal microscopio e atterra sul soffitto direttamente sopra, oppure è centrato su una scheda posizionata sulla montatura dell'obiettivo nella torretta.
  10. OPZIONALE: La determinazione del corretto allineamento può essere facilitata dall'uso di un campione di colorante in soluzione (in questo caso, Rodamina B a ~100 μM in acqua o metanolo con profondità di >0,5 cm per scopi visivi), posizionato sul tavolino del campione con la lente dell'obiettivo 60X in posizione. Se il raggio è allineato correttamente, l'obiettivo proietterà un cono di fluorescenza allineato con l'asse dell'obiettivo e del microscopio. Piccole deviazioni nel posizionamento del raggio laser nell'apertura posteriore dell'obiettivo causeranno l'allontanamento del cono da un allineamento puramente verticale.
  11. Bloccare entrambe le travi. Montare L1 nel percorso del laser alla distanza appropriata (cioè una lunghezza focale) dall'apertura posteriore della lente dell'obiettivo. Con l'obiettivo 60X in posizione, lasciare che il raggio di lettura venga proiettato sul soffitto. Regolare la posizione orizzontale e verticale di L1 (perpendicolare alla direzione di propagazione del laser) fino a quando il raggio non è centrato sopra il microscopio. Nota: in questo passaggio, il raggio formerà un punto più grande rispetto al passaggio precedente.
  12. La posizione assiale di L1 e la sua lunghezza focale influenzeranno la dimensione dell'area illuminata sul campione. In senso stretto, il calcolo del profilo di illuminazione sul campione deve tenere conto della diffrazione23. In parole povere, tuttavia, posizionando L1 a una distanza assiale diversa da una lunghezza focale dal piano focale posteriore dell'obiettivo, in molti casi si otterrà un profilo di illuminazione laser più piccolo e più intenso rispetto a quando L1 si trova esattamente a una lunghezza focale dal piano focale posteriore. Un'area illuminata più piccola può essere utilizzata per produrre un'intensità laser più elevata per determinate applicazioni, come ad esempio l'imaging ad alta velocità.
  13. Misurazione del profilo del fascio di lettura. Con L1 in posizione, posizionare un campione di soluzione colorante concentrata appropriata (in questo caso, rodamina B a ~100 μM in acqua) sul tavolino.
  14. Con il laser di attivazione bloccato, proiettare il laser di lettura (regolare ND1 per ottenere una potenza <<1 mW per tutti i raggi esposti) attraverso l'obiettivo 60X e nel colorante e (con il guadagno EM disabilitato) inviare questa immagine alla telecamera.
  15. Focalizzare l'obiettivo nel campione. Per questa fase, è necessaria un'apertura sufficientemente ampia da consentire l'imaging del profilo dell'intero raggio.
  16. Traslare lateralmente l'AP in modo che il centro del profilo della trave e l'AP siano concentrici. Utilizzando il software della fotocamera, scegliere la regione di interesse per consentire la più piccola regione di lettura della telecamera che incapsula entrambi i canali. Registra queste coordinate. Registra una singola istantanea (questo è il profilo del raggio di lettura).
  17. Le immagini che riflettono più correttamente il profilo laser sul piano focale saranno ottenute quando il campione di soluzione colorante è il più sottile possibile. Un campione così sottile può essere creato posizionando una goccia di ~5 ul di soluzione colorante tra un vetrino da microscopio e un vetrino coprioggetti.
  18. Misurazione del profilo del raggio di attivazione. Blocco del laser di lettura. Proiettare il laser di attivazione sul campione; e proiettare questa immagine attraverso la fotocamera.
  19. Se necessario, utilizzare EM gain <100 e regolare DM1 fino a quando il raggio non è centrato in ciascun FOV. Registrare un'istantanea del profilo del raggio di attivazione.
  20. Misura la potenza di ogni raggio. Rimuovere la soluzione colorante e posizionare un sensore del misuratore di potenza sopra l'obiettivo 60X (senza mezzi di immersione). Misurare la potenza di ciascun raggio (attivazione e lettura) separatamente. Si noti che la posizione del misuratore di potenza deve essere regolata con attenzione per garantire che tutta la potenza laser emessa colpisca il sensore del misuratore di potenza.
  21. Per ogni laser, utilizzare filtri a densità neutra (ND1 e ND2) per regolare la potenza in modo da produrre intensità al campione appropriato per l'esperimento.
  22. Intensità del laser di lettura per l'acquisizione delle immagini. L'intensità del laser di lettura dovrebbe essere sufficientemente alta da eccitare e sbiancare le singole molecole nell'arco di pochi fotogrammi. I valori tipici sono 103-10 4 W/cm2 (vedi anche Gould et al.4). L'intensità al campione dipende dalle dimensioni dell'area dell'immagine, quindi la potenza richiesta per raggiungere l'intensità desiderata varierà da sistema a sistema.
  23. Intensità del laser di attivazione. L'intensità del laser di attivazione deve essere scelta in modo tale che il numero di molecole attive sia piccolo (ad esempio 1-100) in un dato frame di acquisizione. In parole povere, la densità desiderata viene raggiunta quando la distanza più vicina tra le molecole attive è leggermente maggiore della risoluzione limitata dalla diffrazione (vedi anche Sezione 6, Imaging). Poiché la popolazione di singole molecole inattive diminuisce, sono necessarie intensità più elevate del laser di attivazione. Le intensità tipiche sono 10-1-10 2 W/cm2.
  24. Ottimizza la piastra a quarto d'onda. La piastra a quarto d'onda (QWP) è opzionale, ma l'aumento del grado di polarizzazione circolare della lettura e dei laser di attivazione con una QWP può aumentare la densità delle molecole nelle immagini finali. Per ottimizzare la QWP, posizionare un polarizzatore tra la QWP e l'M5. Blocca il laser di attivazione. Proiettare il laser di lettura attraverso un misuratore di potenza sopra l'obiettivo 60X a secco.
  25. Registra l'angolo della QWP. Regolare il polarizzatore fino al massimo, quindi si raggiungono le potenze minime. Registra ciascuno di questi valori e calcola il rapporto tra minimo/massimo. Regolare l'angolo della QWP e ripetere queste misurazioni. Sebbene sia auspicabile ottenere valori il più vicino possibile a 1,0, un rapporto di >0,8 è sufficiente per l'imaging.

4. Creare un Campione Durevole di Perline per l'Allineamento dei Canali

  1. Diluire un campione di perle fluorescenti (da 40 a 100 nm di diametro) 1:70 in acqua di grado HPLC. Diluire ulteriormente questa soluzione madre 1:15 in acqua HPLC, per un volume finale di 200 μl di sospensione di perle in acqua.
  2. Rivestire un vetrino coprioggetti con poli-L-lisina liquida. Incubare a RT per 30 min. Aspirare per rimuovere la soluzione e lavare il vetrino coprioggetti tre volte con acqua HPLC. Aspirare ogni traccia di acqua dal vetrino coprioggetti e lasciare asciugare a RT.
  3. Pipettare 200 μl della sospensione del cordone sul vetrino coprioggetti. Lasciare questo vetrino coprioggetti per 20 minuti a RT prima di lavarlo tre volte con acqua HPLC. In alternativa, lasciare il vetrino coprioggetti O/N su RT per consentire alla sospensione di asciugarsi.
  4. Utilizzando ~20 μl di acqua HPLC o mezzo di montaggio, montare il vetrino coprioggetti su un vetrino. Sigillare la periferia del vetrino coprioggetti con smalto trasparente. Una volta che lo smalto si è asciugato, posizionare il vetrino coprioggetti (e il mezzo di immersione dell'obiettivo appropriato; acqua o olio) sull'obiettivo 60X.

5. Acquisizione di immagini: Campione di perline di imaging per l'allineamento dei canali di rilevamento

  1. Illuminare il campione di perlina con il raggio laser di lettura a un'intensità circa 10 volte inferiore a quella utilizzata per l'imaging. Con il guadagno EM impostato su 100, proiettare l'immagine sulla fotocamera e regolare la messa a fuoco fino a quando le perline non sono visibili in entrambi i canali.
  2. Se le perline sono deboli, aumentare la potenza del laser o il guadagno EM. La minimizzazione del rumore nelle immagini a microsfere (rilevando un gran numero di fotoni, ovvero almeno 5.000 in totale da ciascuna perlina) è fondamentale per una registrazione accurata del canale. Configura la fotocamera per registrare 100 fotogrammi, con lo stesso tempo di esposizione che verrà utilizzato per l'imaging FPALM successivo.
  3. Cerca le regioni in cui le perle sono distribuite sia al centro che alla periferia dei canali e dove la densità delle perle è sufficientemente bassa da consentire alle singole perle di essere ben separate e di poter essere identificate individualmente.
  4. Acquisisci tra 10-20 set di immagini di diverse regioni a queste densità di perline. Vedere la sezione dei risultati per i dettagli sull'utilizzo delle immagini del cordone per la calibrazione del canale.

6. Acquisizione immagini: Multicolor FPALM

  1. È importante visualizzare le cellule che sono state trasfettate con solo uno di ciascuno dei costrutti, nonché registrare le immagini delle cellule con tutti i costrutti. Questi dati aiuteranno a stabilire gli istogrammi alfa di ciascuna delle sonde utilizzate e sono necessari per l'interpretazione di dati multicolore.
  2. Trova le celle che esprimono sonde fotocommutabili, se in uso. Elimina tutta l'illuminazione della stanza. Proiettare la lampada al mercurio, tramite il supporto flip (FM), sul campione (contenente celle trasfettate). Sostituire il cubo del filtro della torretta con uno contenente la combinazione di specchio dicroico/filtro appropriata per consentire l'eccitazione dello stato di prefotocommutazione dell'etichetta. Ad esempio, per l'imaging di Dendra2 prefotocommutato, o sonde con un'emissione precommutata verde, una scelta per DM4 è un dicroico che riflette la luce blu (<488 nm) e per F5 è un filtro che passa la luce da ~500-570 nm, bloccando la luce al di fuori di questo intervallo.
  3. Utilizzando l'oculare, cercare le cellule che esprimono la sonda prefotografica. Ad esempio, le celle che esprimono Dendra2 appariranno verdi. Si noti che non tutte le sonde sono fotocommutabili e, a seconda dei loro spettri di emissione precommutati, quelle che lo sono potrebbero richiedere combinazioni di DM4/F5 diverse da quelle elencate qui.
  4. Una volta scelta una cella, spostare l'FM verso il basso per consentire ai laser di passare nel microscopio (bloccare la luce al mercurio dal percorso). Cambiare la torretta del filtro con quella contenente il dicroico appropriato per l'imaging (in questo caso, DM2 dovrebbe riflettere sia la lettura che l'attivazione del laser, trasmettendo lunghezze d'onda più lunghe, e F1 dovrebbe trasmettere lunghezze d'onda al rosso del laser e idealmente presentare un'elevata soppressione alla lunghezza d'onda del laser).
  5. Se le cellule non esprimono una sonda fotocommutabile, cercare le cellule proiettando l'immagine sulla fotocamera e utilizzando il laser di lettura per illuminare il campione. Le singole molecole saranno probabilmente visibili (vedi Figura 3) in molte delle cellule.
  6. Per distinguere le cellule trasfettate dalla fluorescenza di fondo (che possono ancora apparire come molecole lampeggianti singolarmente) e per confermare che le molecole sono fotoattivabili, illuminare brevemente il campione con una bassa potenza del laser di attivazione (tipicamente dell'ordine dei microwatt). Il numero di molecole fotoattivabili visibili sotto il raggio di lettura dovrebbe aumentare notevolmente e rimanere elevato per un breve periodo anche dopo che l'illuminazione di attivazione è stata nuovamente bloccata. Si noti che sonde diverse possono variare considerevolmente in termini di luminosità, efficienza di fotoconversione e potenza laser richiesta per l'attivazione24-27.
  7. Preparare il software della fotocamera per un'acquisizione cinetica in serie impostando il guadagno EM su 200 e scegliendo il numero desiderato di fotogrammi (in genere 5.000-10.000) e il tempo di esposizione (in genere 10-30 msec è appropriato). Mentre il guadagno EM può essere impostato su un valore superiore a 200, oltre un certo punto l'aumento del guadagno EM può aumentare il rumore.
  8. Bloccare il raggio di attivazione. Sblocca il raggio di lettura e proietta l'immagine della cella illuminata sulla telecamera.
  9. Verificare che la cella sia trasfettata (passaggio 6.6). Mentre osservi la cellula, regola la messa a fuoco fino a quando non è visibile il piano focale desiderato e le molecole sono a fuoco.
  10. Per scegliere un piano focale che riprenda le immagini vicino alla membrana cellulare inferiore, spostare la messa a fuoco verso il basso fino a quando le singole molecole non sono più visibili. Quindi, sposta gradualmente la messa a fuoco verso l'alto fino a quando le molecole diventano visibili per la prima volta.
  11. Per scattare un'immagine vicino alla membrana cellulare superiore, continuare a spostare la messa a fuoco verso l'alto della quantità desiderata, annotando la distanza utilizzando la manopola di messa a fuoco del microscopio o la messa a fuoco automatica. La scelta di una regione di messa a fuoco compresa tra questi due limiti si tradurrà in una regione al centro della cella da riprendere.
  12. Sbloccare il raggio di attivazione e illuminare il campione a bassa intensità (utilizzare i filtri ND2 per attenuare il raggio a un'intensità molto bassa, circa <1 W/cm2 al campione).
  13. Inizia l'acquisizione dei dati. Si desidera un'alta densità di molecole attive; Tuttavia, è fondamentale per le fasi di analisi che queste molecole non si sovrappongano spazialmente.
  14. Tentare di mantenere una densità di molecole fotoattivabili visibili di ~0,1-1 μm-2 regolando ND2. Tipicamente, per una regione dell'immagine di ~10-20 μm di diametro, ci saranno ~10-100 molecole visibili contemporaneamente (vedere le Figure 3 e 4 per riferimento). Poiché il numero di molecole inattive rimanenti diminuisce nel corso dell'acquisizione, potrebbe essere necessario aumentare gradualmente la potenza del laser di attivazione per mantenere la densità.
  15. Se si desidera l'imaging TIRF*, M5 e L1 devono essere entrambi montati su un singolo stadio di traslazione (TS, Figura 1) per essere spostati lateralmente (cioè in una direzione perpendicolare al laser appena dietro l'ingresso del microscopio). Man mano che M5 e L1 vengono traslati, i laser che escono dall'obiettivo verso l'alto attraverso il campione si inclineranno gradualmente da un lato (ATTENZIONE: pericolo per la sicurezza del laser).
  16. Quando l'angolo dei laser raggiunge i 90° rispetto alla verticale, il laser emergente stesso svanirà, il laser di lettura in arrivo verrà retroriflesso, emergendo come un raggio che viaggia fuori dall'apertura posteriore dell'obiettivo, antiparallelo al raggio in arrivo e spostato lateralmente.
  17. Contemporaneamente, la fluorescenza di fondo diventerà quasi completamente attenuata e lo spessore della regione del campione contenente singole molecole distinguibili e focalizzate sarà notevolmente ridotto.
    *TIRF consentirà l'imaging di una sezione sottile del campione che si trova ~100-500 nm sopra il vetrino coprioggetti. L'imaging dei piani focali che si trovano più all'interno del campione è facilmente ottenibile utilizzando l'illuminazione a campo largo (Sezione 3), ma non è appropriato per TIRF.
  18. Al termine dell'acquisizione, chiudere immediatamente l'otturatore del microscopio e bloccare entrambi i raggi. Disabilita il guadagno EM, imposta la fotocamera per registrare un fotogramma e imposta la regione di lettura della fotocamera sulla sua dimensione massima.
  19. Blocca un canale posizionando una scheda su F3 o F4. Con un filtro passa-lungo (>580 nm) montato sulla lampada del microscopio, illuminare il campione e proiettare questa immagine sulla fotocamera. Registra un'istantanea della cella.
  20. OPZIONALE: Con un canale ancora bloccato, aprire l'apertura in modo che un'ampia area del campione sia visibile dall'illuminazione a luce trasmessa. Registra un'istantanea. Queste immagini a luce trasmessa sono molto utili per visualizzare il contesto delle corrispondenti immagini FPALM.
  21. Imaging di cellule vive. Per visualizzare le cellule viventi, trasfettare le cellule come per i passaggi 1.1-1.3 ma non fissare questi campioni. Invece, allineare completamente la configurazione come descritto sopra, ma prima di eseguire l'imaging dei campioni, rimuoverli da 37 °C e 5% di CO2, lavare 3 volte in PBS e immergere il campione in un mezzo di imaging (ad es. PBS con 20 mM di glucosio). La rimozione dei terreni di coltura e il lavaggio ridurranno lo sfondo associato alla maggior parte dei terreni cellulari.
  22. Se lo si desidera, i campioni possono essere sottoposti a imaging a RT, come le cellule fissate, o a 37 °C e 5% di CO2 con l'uso di un tavolino di incubazione montato sul tavolino del microscopio. Un singolo campione di cellule NIH 3T3 deve essere immerso in un terreno di imaging per non più di circa 1 ora. Può essere utile monitorare il modo in cui le cellule rispondono all'immersione nei mezzi di imaging prima di prepararsi per esperimenti di questo tipo, per ottimizzare il tempo di immersione e potenzialmente la composizione dei mezzi di imaging per ridurre la perturbazione delle cellule.

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

S.T.H. e M.J.M. detengono brevetti nel campo della microscopia a super-risoluzione. S.T.H. fa parte del comitato consultivo scientifico di Vutara, Inc.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Philip Andresen, Matthew Parent e Sean Carter per la programmazione informatica, l'assistenza tecnica e le utili conversazioni e Pat Byard per l'assistenza amministrativa. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH Career Award K25-AI65459, NIH R15 GM094713, NSF MRI CHE-0722759, Maine Technology Institute MTAF 1106 e 2061 e dal Maine Economic Improvement Fund.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Camere LabTek IINunc
Perline fluorescentiInvitrogenF-8801Perline per calibrazione
Perline TetraspeckInvitrogenT-7279Perline a quattro colori per la calibrazione
Olio da immersione per obiettivoZeiss518FOlio da immersione per obiettivo ad alta NA (a seconda della scelta dell'obiettivo)
Acqua HPLCFisher ScientificW5-4
MediaATCC30-2003O Cellgro 10-090
AntibioticiGIBCO15070-063
sieroThermo ScientificSH30087.03
LipofectamineInvitrogen52887
Optimem IGIBCO11058-021
TripsinaMPBiomedicals
paraformaldeideFisher ScientificAA433689MATTENZIONE: Tossico
1689149

Riferimenti

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