Articolo metodologico

Utilizzo di un sistema di tracciamento 3D automatizzato per registrare singoli e banchi di pesci zebra adulti

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DOI:

10.3791/50681

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5 dicembre 2013

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1R&D, xyZfish

In questo articolo

Sommario

Viene descritto l'uso di un sistema video automatico 3D in grado di tracciare singoli e gruppi di pesci zebra. Come esempio applicativo esploriamo gli effetti dell'antagonista del recettore NMDA MK-801 sui banchi di zebrafish.

Abstract

Come molti animali acquatici, il pesce zebra (Danio rerio) si muove in uno spazio 3D. È quindi preferibile utilizzare un sistema di registrazione 3D per studiarne il comportamento. Il sistema di tracciamento video automatico presentato realizza ciò utilizzando un sistema a specchio e una procedura di calibrazione che corregge il notevole errore introdotto dal passaggio della luce dall'acqua all'aria. Con questo sistema è possibile registrare sia singoli che gruppi di pesci zebra adulti. Prima dell'uso, il sistema deve essere calibrato. Il sistema è composto da tre moduli: Registrazione, Ricostruzione del percorso ed Elaborazione dei dati. Vengono presentati i protocolli passo-passo per la calibrazione e l'utilizzo dei tre moduli. A seconda della configurazione sperimentale, il sistema può essere utilizzato per testare la neofobia, l'avversione bianca, la coesione sociale, le disabilità motorie, l'esplorazione di nuovi oggetti, ecc. È particolarmente promettente come strumento di primo passo per studiare gli effetti di farmaci o mutazioni sui modelli comportamentali di base. Il sistema fornisce informazioni sulla distribuzione verticale e orizzontale del pesce zebra, sulle componenti xyz dei parametri cinematici (come locomozione, velocità, accelerazione e angolo di virata) e fornisce i dati necessari per calcolare i parametri per le coesie sociali durante i test dei banchi.

Introduzione

Il pesce zebra è diventato un modello importante per la ricerca biologica e farmacologica1-3. Il monitoraggio dei modelli di movimento e di distribuzione spaziale dei singoli pesci zebra e dei banchi di pesci zebra è inestimabile. Gli studi più vecchi applicano la quantificazione manuale basata sulle immagini registrate4. Ora, i sistemi di tracciamento video automatico 2D sono comunemente usati5. Tuttavia, poiché il pesce zebra e molti altri animali acquatici e non acquatici si muovono in uno spazio tridimensionale, l'interesse per i sistemi 3Dsta crescendo6. Il sistema 3D descritto è stato pubblicato per la prima volta nel 20077. Per dettagli tecnici e confronti con altri sistemi vedere8. Il vantaggio fondamentale di questo sistema rispetto ad altri sistemi è che acquisisce due (opzionalmente tre) viste sincrone e indipendenti utilizzando un sistema di mirroring e che utilizza un protocollo di calibrazione a due fasi. Nella prima fase, viene calibrata la geometria 3D dell'impianto stereo (formato dalla fotocamera e dagli specchi). Nella seconda fase, vengono corretti gli errori non lineari introdotti dalla rifrazione della luce. Quando si studiano gli animali acquatici, l'impatto della rifrazione della luce può essere considerevole se non corretto. Altri sistemi finora pubblicati (anche gli sviluppi più recenti9) omettono la procedura di calibrazione in due fasi. Per dettagli tecnici sull'identificazione degli oggetti, l'occlusione con tracciamento multi-oggetto, il rumore jigging, ecc. Si rimanda il lettore alle pubblicazioni originali8,9. Il sistema è stato validato per lo studio delle risposte comportamentali ansioso-simili10,11, allo shoaling8,11,12 e, in uno studio preliminare, per il comportamento antagonista nel pesce zebra13. È stato testato anche per altre specie ittiche (pesce rosso8, coda di spada, barbo tigre) e per topi9.

Di seguito vengono descritti i protocolli per la calibrazione e per l'utilizzo del sistema e vengono presentati i risultati di un esperimento che testa gli effetti dell'antagonista non competitivo MK-801 sul pesce zebra in branco come esempio rappresentativo per dimostrare il tipo di dati che possono essere ottenuti con il sistema.

Sia nell'ambiente naturale che negli acquari, il pesce zebra di solito nuota nei banchi14. Le preferenze di allevamento sembrano dipendere da diversi fattori, come l'allevamento, il sesso e la disponibilità di cibo14,15. È interessante notare che la distanza tra i singoli pesci zebra in un branco si riduce quando sono presenti segnali di potenziale pericolo, come i feromoni di allarme16 o la novità11. Il paradigma dello shoaling viene quindi utilizzato anche per testare farmaci ansiolitici17. Le gerarchie di dominanza18 e l'apprendimento sociale19 sono aspetti affascinanti del comportamento del pesce zebra. A causa del suo carattere comportamentale sociale altamente sviluppato, il pesce zebra è diventato anche di interesse per la ricerca sull'autismo20,21.

MK-801 è stato segnalato per alterare il comportamento sociale nel pesce zebra5,22,23, che ricorda i suoi effetti sui mammiferi24. Tuttavia, MK-801 ha anche molti altri effetti su altri comportamenti (come il comportamento di nuoto, l'evitamento inibitorio e la preferenza di luogo25-27). Pertanto, è fondamentale, negli esperimenti iniziali, ottenere quante più informazioni possibili dalle osservazioni di base. Ciò fornirà la base per la progettazione di esperimenti più mirati.

Indagine sull'apparato di registrazione e sul software

Nella sua configurazione attuale, il contenitore di osservazione (25 cm x 25 cm x 18 cm, L x P x A), che contiene il pesce zebra, è posizionato nella camera di osservazione (91 cm x 46 cm x 56 cm, L x P x A). La camera contiene anche una telecamera, uno specchio sospeso a circa >45° sopra il contenitore e barre luminose a LED. La Figura 1 mostra un diagramma semplificato. La telecamera registra sia la vista frontale che la vista dall'alto (specchio) per costruire le traiettorie 3D del pesce zebra determinando le sue coordinate x, y e z. Ai fini dell'orientamento, i vettori di coordinate sono presentati nell'angolo anteriore sinistro del contenitore di osservazione (posizione rispetto alla telecamera), che corrisponde ai vettori presentati nelle viste 3D (ad es. Figura 15) generate dal Path Reconstruction Module (vedi più avanti). La frequenza di campionamento dipende dalla fotocamera e dal computer. Nei nostri esperimenti è di circa 40 fotogrammi/sec (fps). La risoluzione spaziale dei fotogrammi registrati è di 640 x 480 pixel (questa configurazione è stata scelta come equilibrio ottimale tra risoluzione spaziale e temporale). È richiesto Windows XP o superiore.

Prima della prima registrazione, il sistema deve essere calibrato per determinare le posizioni delle pareti del contenitore e della superficie dell'acqua, per determinare il fattore di scala dei fotogrammi registrati e per regolare l'errore considerevole generato dalla rifrazione della luce quando passa dall'acqua all'aria. In linea di principio, la calibrazione deve essere eseguita solo durante l'installazione iniziale e dopo che parti della configurazione, come la fotocamera o lo specchio, sono state spostate o sostituite. Tuttavia, è buona norma verificare di tanto in tanto se la calibrazione è ancora corretta e ricalibrare, se necessario.

Il software è composto da tre moduli. Il Recordings Module registra i fotogrammi (due fotogrammi di esempio sono mostrati nella Figura 2). Il modulo Traiettoria ricostruisce i percorsi di ogni zebrafish. Il modulo di elaborazione dati calcola una serie di parametri cinematici e spaziali standard. Ai fini di ulteriori analisi, i dati possono essere importati in fogli di calcolo o software statistici.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida del National Institute of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Calibrazione

  1. Posizionare un contenitore di osservazione vuoto nella camera in modo che i piedini del contenitore siano inseriti nei fori previsti per il corretto allineamento. Orientare il contenitore in modo tale che le pareti semitrasparenti (lo scopo della loro struttura è quello di ridurre i riflessi) siano rivolte verso il lato opposto e a destra della fotocamera.
  2. Apri il modulo di registrazione, seleziona "Controllo fotocamera" e regola "guadagno" e "otturatore" (dopo averli deselezionati, caselle a destra) in modo che l'immagine sia chiara. Posizionare lo specchietto laterale con un angolo di circa 45° sul lato sinistro del contenitore di osservazione, in modo che la vista laterale del contenitore sul monitor del computer sia completamente visibile. Inoltre, lo specchio deve essere allineato in modo tale che la parete anteriore del contenitore sia vista come una linea (come indicato dalla freccia nella Figura 3).
  3. Collegare il pannello di calibrazione alla porta parallela (della scheda della fotocamera) e premere il pulsante "Pannello LED on/off" nel modulo di registrazione per accendere i LED.
  4. Posizionare il pannello di calibrazione nel contenitore di osservazione vuoto in modo che i 5 LED possano essere visti nelle viste anteriore, superiore e laterale sul monitor del computer come nella Figura 3 (a volte il cavo blocca la vista, in questo caso lo sposta). Assicurarsi inoltre che i LED siano al di sotto dei segni del livello dell'acqua (questi segni sono incisi nei contenitori di osservazione a 135 mm dal fondo interno del serbatoio) e che la posizione del pannello sia stabile (in modo che non si muova quando si riempie il contenitore con acqua al punto 1.9).
  5. Spegnere le luci nella camera di osservazione e chiudere la tendina (fare attenzione a non toccare il cavo del pannello di calibrazione o lo specchietto laterale).
  6. Premere il pulsante 'Posizione dati' e creare o selezionare una cartella per i file di calibrazione. Questi file verranno utilizzati per tutte le registrazioni successive (o esperimenti) fino a quando non sarà necessaria una ricalibrazione. Pertanto, idealmente, rendere i dati di calibrazione parte del nome della cartella di calibrazione.
  7. Regolare le tre caselle rosse sullo schermo del computer in modo che ciascuna includa solo i 5 LED in una qualsiasi delle tre viste (Figura 4, pannello di sinistra). Anche in questo caso, utilizzare "guadagno" e "otturatore" in "Controllo fotocamera" per ottenere immagini nitide dei LED, senza immagini di altri punti luminosi (dovuti a rumore, riflessi o goccioline d'acqua sulla parete del contenitore), come nella Figura 4, pannello di destra.
  8. Spegnere i LED e premere il pulsante "Raccogli calibrazione senza acqua". Sullo schermo del computer compaiono 5 tag ('x') numerati da 0 a 4. Accendere il pannello. Le posizioni dei tag devono coincidere con i LED. In caso contrario, ripetere il passaggio 1.7 (vedere la Figura 4 per l'illustrazione dell'errata assegnazione dei tag sul pannello di sinistra e della corretta assegnazione dei tag sul pannello di destra).
  9. Riempire la camera di osservazione con acqua fino al segno. I LED devono essere sotto il livello dell'acqua (come spiegato nel passaggio 1.4). Se si trovano sopra il livello dell'acqua, svuotare il contenitore e tornare al passaggio 1.4. Quando si riempie l'acqua nel contenitore, fare attenzione che il pannello LED non si muova. Tuttavia, se ciò dovesse accadere, svuotare il contenitore e tornare al passaggio 1.4. Questo è importante, perché la calibrazione si basa sulla determinazione delle differenze tra le posizioni dei LED registrate senza e con acqua.
  10. Premere il pulsante "Raccogli calibrazione con acqua". Anche in questo caso, come nel passaggio 1.8, sullo schermo appariranno cinque tag, che nella maggior parte dei casi saranno leggermente sfalsati rispetto a quelli ottenuti durante la calibrazione senza acqua. In questo passaggio, potrebbe essere necessario regolare nuovamente il guadagno e l'otturatore. Ripetere fino a quando i tag non sono posizionati correttamente sopra i LED (come nella Figura 4, pannello di destra).
  11. Accendere le luci nella camera di osservazione, regolare il guadagno e l'otturatore (in "Controllo fotocamera") in modo che l'immagine non sia eccessivamente luminosa.
  12. La Figura 5 mostra i sei punti che devono essere selezionati in sequenza facendo clic con il pulsante destro del mouse. Assicurarsi che i punti si trovino sulle linee designate: 1. livello dell'acqua vista frontale, 2. cresta superiore sinistra del contenitore nella vista superiore, 3. linea verticale che delinea la parete anteriore nella vista laterale. La lunghezza della linea non è essenziale. Tra le posizioni di clic 1 e 2, 3 e 4 e 5 e 6, appariranno delle linee rette (i numeri non appariranno effettivamente sullo schermo). Premi "Raccogli informazioni sul contenitore" per salvare queste informazioni.
  13. Rimuovere sia lo specchietto laterale che il pannello LED e riempire l'acqua esattamente fino al segno. Seleziona "Avvia registrazione". Una nuova finestra richiede la durata in minuti. Per lo scopo attuale è sufficiente 1 minuto. Premere OK.
  14. Dopo la registrazione, uscire dal modulo di registrazione, aprire il modulo traiettoria, selezionare la cartella di calibrazione (effettuata al punto 1.6) con 'Posizione dati' (il caricamento del file potrebbe richiedere del tempo). Questa cartella contiene i file di calibrazione e i file dei dati appena registrati (passaggio 1.13).
  15. Premi il pulsante "Acquisisci sfondo". Si apre una nuova finestra, senza cambiare nulla premere OK. Attendere fino a quando sul monitor appare un'immagine (capovolta) della vasca di osservazione. Quindi premere "Carica sfondo". L'immagine di sfondo verrà corretta. Si apre una nuova finestra che richiede di regolare le caselle. Basta premere OK.
  16. Premere in sequenza il pulsante dal terzo al settimo: 'Carica corrispondenza senza acqua', 'Calibra telecamera(e) virtuale(i), 'Carica corrispondenza rifratta', 'Raccogli geometrie contenitore', 'Recupera informazioni contenitore animale'. Quest'ultimo passaggio può richiedere diversi minuti. Viene completato quando sullo schermo vengono visualizzate tre linee bianche (che sono le linee disegnate nel passaggio 1.12). Premere il pulsante "Salva informazioni contenitore".
  17. Premi il pulsante "Raccogli volume". Ora, come mostrato nella Figura 6, segna consecutivamente gli 8 angoli del corpo idrico, che è un cuboide. Per ogni punto, fare clic prima nella vista frontale e poi nella vista dall'alto.
  18. Seleziona "3D" nell'angolo sinistro della finestra. Ora si apre una nuova finestra che mostra il contorno di una scatola con il fondo bianco (come in Figura 15, ma senza la traiettoria). Fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare le rotazioni e le traslazioni della visualizzazione a casella. Se non appare alcuna immagine o se l'immagine non è quella di un cuboide (ad esempio nel passaggio 1.17 gli angoli sono stati cliccati con il pulsante destro del mouse nell'ordine sbagliato), procedere come segue: mentre si esce, ma non si chiude il modulo Traiettoria, utilizzando Windows andare alla cartella di calibrazione (effettuata nel passaggio 1.6), selezionare la sottocartella 'Animal container data' ed eliminare il file denominato TankVertices e ripetere il passaggio 1.17.
  19. Congratulazioni, la calibrazione è completata. Idealmente, dovrebbe essere eseguita una corsa di prova con un pesce fittizio per verificare se tutto funziona bene. La buona notizia è che la ricalibrazione deve essere eseguita solo se le posizioni dello specchio o della fotocamera sono state (anche solo leggermente) modificate o se ci sono problemi con l'inseguimento (vedi sezione 3).

2. Registrazione

  1. Posizionare il contenitore di osservazione riempito d'acqua fino ai segni nella camera di osservazione in modo che i piedini del contenitore siano inseriti nei fori previsti per il corretto allineamento. Orientare il contenitore in modo che le pareti semitrasparenti (o le pareti bianche nel nostro esempio - vedere la discussione) siano rivolte verso il lato opposto e a destra come visto dalla fotocamera.
  2. Accendi le luci nello scomparto, metti il pesce (sperimentale o finto) nel contenitore e chiudi le tende. Nota: il sistema può registrare più pesci (vedi la sezione Risultati rappresentativi); Tuttavia, è consigliabile acquisire una certa esperienza con il sistema registrando prima i singoli pesci.
  3. Apri il modulo di registrazione. Sullo schermo appare l'immagine della vista frontale e superiore (a specchio) del contenitore. L'immagine potrebbe non essere ideale (ad es. sovraesposta, ad es. Figura 7) e potrebbe essere necessario regolarla (i prossimi tre passaggi) per ottenere un buon contrasto tra il pesce e lo sfondo (ad es. Figura 8).
  4. Selezionare 'Controllo fotocamera' e, nella finestra 'Impostazioni generali' che si apre, regolare 'Otturatore' e 'Guadagno' (dopo aver deselezionato le caselle corrispondenti a destra, vedere la Figura 9) in modo tale che l'immagine non sia sovraesposta e ci sia un buon contrasto tra pesce e sfondo.
  5. Sul lato sinistro della finestra 'Controllo telecamera' selezionare 'Bilanciamento del bianco/Colore' e nella nuova finestra deselezionare la casella 'Auto' e regolare i valori di Rosso e Blu (vedere la Figura 10) per ottenere il miglior contrasto cromatico sia nella vista frontale che in quella superiore.
  6. Potrebbe essere necessario passare alcune volte dalla regolazione del colore (in "Bilanciamento del bianco/Colore") alla regolazione del guadagno e dell'otturatore (in "Impostazioni generali") per ottenere la migliore impostazione della fotocamera. Tieni presente che anche se dovessi essere soddisfatto senza alcuna regolazione, è fondamentale deselezionare le caselle "Otturatore", "Guadagno" e "Auto" (come spiegato nei passaggi 2.4 e 2.5), altrimenti lo sfondo fluttuerà nel corso della registrazione, il che rende impossibile estrarre le traiettorie. Non modificare le altre impostazioni. Al termine, chiudi la finestra "Controllo fotocamera".
  7. Dal menu principale del modulo di registrazione, selezionare "Posizione dati" per creare o aprire una cartella creata in precedenza. Si noti che ogni registrazione (ad esempio pesce o branco) ha la propria cartella che idealmente dovrebbe essere una sottocartella della cartella dell'esperimento.
  8. Premi "Avvia registrazione". Si apre una finestra che chiede la durata della registrazione in minuti (inserire solo numeri interi). Premere 'OK', che avvia la sessione di registrazione effettiva.
  9. Una volta completata la registrazione, uscire dal programma. Prima di registrare il pesce successivo, si consiglia di riavviare il computer. Utilizzare l'opzione Riavvia in Windows per preservare le impostazioni della fotocamera (dai passaggi 2.4 e 2.5). La necessità di riavviare il computer tra una registrazione e l'altra è dovuta ad alcuni problemi con la scheda della fotocamera.
  10. Prima di passare al modulo Traiettoria per la ricostruzione del percorso, copiare e incollare le sottocartelle "Dati del contenitore animale" e "Dati di corrispondenza" dalla cartella di calibrazione (effettuata nella prima sezione di questo protocollo) in ogni cartella creata durante la registrazione. In queste ultime cartelle sono presenti altre due sottocartelle, ovvero "Dati grezzi" e "Timestamp". Il primo contiene tutti i fotogrammi registrati in formato JPEG; Quest'ultimo contiene informazioni sul numero totale di fotogrammi e sugli intervalli tra i fotogrammi (in msec).

3. Ricostruzione del percorso

  1. Aprire il modulo Traiettoria, premere 'Posizione dati' per selezionare la cartella creata con il modulo Record, quindi premere il pulsante 'Configurazione del sistema' per aprire i 'Parametri' (vedere la Figura 11).
  2. Selezionare le soglie di colore della vista dall'alto e dal basso. Un buon valore iniziale è 1.000. Se questo valore è basso, è più probabile che il software registri il rumore. Tuttavia, se il valore è troppo alto, il pesce potrebbe essere al di sotto del campo di rilevamento. Successivamente (passaggi 3.11 e 3.12) potrebbe essere necessario regolare nuovamente le soglie di colore. Si noti inoltre che le soglie di colore superiore e inferiore non devono essere le stesse.
  3. Selezionare le soglie delle dimensioni della vista superiore e inferiore. Un buon valore iniziale per un pesce zebra di medie dimensioni è 10, per uno molto grande 20 e per uno molto piccolo 5. Più alta è la soglia di dimensione, minore è la probabilità di rilevare il rumore. Tuttavia, se è troppo alto, il software potrebbe non essere in grado di rilevare il pesce. Anche in questo caso, nei passaggi 3.11 e 3.12 potrebbe essere necessario modificare nuovamente le soglie delle dimensioni. Si noti inoltre che le soglie delle dimensioni superiore e inferiore non devono essere le stesse.
  4. Per 'Soglia dimensione superiore' un valore di 3.000 è solitamente buono e per 'Lunghezza specifica' lasciarlo a 220 (già preimpostato). Il "Numero di pesci" si riferisce al numero di pesci presenti nella vasca di osservazione. Il 'numero massimo di punti' si riferisce al numero totale di fotogrammi. Ricorda (o annota) questo numero o uno leggermente inferiore (ad esempio, 45.703 potrebbe essere memorizzato come 45.000). Premere OK.
  5. Premere in sequenza i pulsanti 'Carica corrispondenza senza acqua', 'Calibra telecamera/e virtuale/i) e 'Carica informazioni sul contenitore degli animali'. Se le sottocartelle di calibrazione "Dati del contenitore animale" e "Dati corrispondenti" non sono state copiate nella cartella sperimentale corrente (vedere il passaggio 2.10). In tal caso, copia e incolla quelle sottocartelle ora e premi nuovamente i pulsanti.
  6. Premi il pulsante 'Acquisisci sfondo'. Una nuova finestra chiederà di inserire 'da' e 'a' con i valori predefiniti 0 e 100, rispettivamente. Cambia 100 nel numero massimo di fotogrammi (nell'esempio fornito nel passaggio 3.4 questo potrebbe essere semplificato come 45.000). Premere OK.
  7. Attendi fino a quando non appare un'immagine (distorta). Quindi premere "Carica sfondo" che risulterà nello stabilire l'immagine di sfondo corretta. Il pesce non dovrebbe essere visibile in questa immagine di sfondo. Se il pesce è visibile, cerca di acquisire uno sfondo migliore da altri segmenti di registrazione (ad es. prova 0-1.000, 1.000-2.000 ecc. al punto 3.6).
  8. Se il pesce non si è mosso affatto durante la sessione di registrazione, l'unico modo per acquisire uno sfondo è rimuovere il pesce ed effettuare una nuova breve registrazione senza il pesce, ma con le stesse impostazioni di "Controlli della fotocamera" (questo è importante). Acquisisci lo sfondo e copia la sottocartella "Dati in background" nella cartella sperimentale corrente. Ora premi "Carica sfondo", non premere "Acquisisci sfondo". Si noti che l'apertura e la chiusura della tendina spesso comporta un leggero cambiamento dello sfondo, quindi potrebbe essere necessario regolare le soglie nei passaggi 3.2 e 3.3 per ridurre il rumore. Il passaggio 3.11 mostra come verificare la presenza di rumore.
  9. Dopo aver caricato lo sfondo, regolare le tre caselle rosse (con l'aiuto del mouse) come illustrato nella Figura 12. Le caselle contrassegnano le aree in cui il software sta cercando il pesce. Chiudere la casella a sinistra (cioè ridurla a una linea o a un punto) perché la vista laterale viene utilizzata solo per la calibrazione (come spiegato nel passaggio 1.7).
  10. Premi il pulsante "Inizia a generare traiettorie". Si apre una finestra che richiede il numero di fotogramma iniziale. Vai con lo "0" predefinito. Dopo aver premuto 'OK', si apre la finestra 'Assegnazioni tag' (vedi Figura 13). Premere 'Step forward' finché sullo schermo non viene visualizzato il tag ('X0'). Se l'etichetta non è posizionata sull'immagine del pesce, premere 'No' fino a quando non è posizionata correttamente. Quindi premere "Vai". Se non viene mai assegnato correttamente (o non viene assegnato affatto), premi comunque "Vai" e cerca il problema (passaggio successivo).
  11. Inizia la ricostruzione del percorso. Idealmente, l'etichetta dovrebbe essere sempre (o almeno la maggior parte delle volte) posizionata sull'immagine del pesce. Se viene spesso posizionato in modo errato, apri la finestra "Info" (seconda scelta sopra lo schermo video). La figura 14A mostra il caso ideale, in cui si vedono solo i contorni dei pesci. La Figura 14B mostra un caso di rumore eccessivo che impedisce la corretta assegnazione dei tag. Se si vede un'immagine chiara del pesce senza rumore (come nella Figura 14A), ma l'etichetta non verrà mai o solo raramente assegnata correttamente, allora il motivo più probabile è che la calibrazione è disattivata. Ricalibrare e ripetere la ricostruzione del percorso. Se durante la calibrazione, lo specchio e la fotocamera non vengono spostati, i nuovi dati di calibrazione possono essere utilizzati per le registrazioni eseguite in precedenza.
  12. In caso di rumore eccessivo (come nella Figura 14B), premere 'Stop' nel menu principale e scegliere nuove soglie di colore e dimensione (passaggi 3.2 e 3.3). Controlla anche se le caselle rosse (passaggio 3.9) possono essere ridotte un po' (ad esempio per escludere il rumore generato dai movimenti dell'acqua nella parte superiore). Si noti che a volte il programma è "bloccato" (se non è stato possibile allocare alcun tag): in questo caso riavviare il programma.
  13. Guarda la traiettoria sullo schermo 3D (terza scelta sopra lo schermo). Figura 15. rappresenta un esempio di traiettoria. Facendo clic con il pulsante destro del mouse selezionare tra la rotazione e le traslazioni della configurazione 3D.
  14. Quando la traiettoria è completata, premere in sequenza i pulsanti 'Salva' (non 'Stop', che elimina la traiettoria!), 'Pulizia traiettoria' e 'Livellamento traiettoria'. Si apre una nuova finestra che mostra i parametri del filtro per il livellamento (Figura 16). Non modificare i valori predefiniti prima di aver acquisito maggiore esperienza con il sistema. Premere 'OK'.
  15. A questo punto dovrebbe essere chiaro perché la scelta di una buona impostazione della fotocamera (con un buon contrasto tra pesce e sfondo) prima della registrazione (vedi passaggi 2.4-2.6) è stata così importante. Procedi al trattamento dei dati.

4. Elaborazione dei dati

  1. Innanzitutto, dai un'occhiata alla cartella che è stata utilizzata per registrare il pesce (Figura 17). Contiene le sottocartelle "Dati del contenitore degli animali" e "Dati di corrispondenza" che sono state copiate dalla cartella di calibrazione (passaggio 2.10), le sottocartelle "Timestamp" e "Dati grezzi" che sono state create durante la registrazione del pesce e le sottocartelle "Dati di sfondo" e "Traiettorie" che sono state create durante la ricostruzione del percorso.
  2. La Figura 17 mostra anche che la sottocartella 'Traiettorie' contiene tre file. Il file point.smoothed-file è il file che verrà utilizzato per l'ulteriore elaborazione dei dati. In caso di registrazione di più pesci (ad esempio un esperimento di branco), per ogni pesce verrà generato un file point.smoothed-file separato.
  3. La Figura 18 mostra la parte superiore di un esempio point.smoothed-file. La prima riga fornisce il numero totale di campioni o fotogrammi, la seconda riga la durata della registrazione (in minuti) e la terza riga le coordinate (sequenza: x, z, y) del centro del corpo idrico rispetto alla telecamera. Questo è seguito da una riga per ogni fotogramma che fornisce le coordinate x, y, z (in mm) per il pesce e la durata di quel campione (in secondi).
  4. Ci sono due modi per elaborare i dati forniti nei file point.smoothed: utilizzare il Data Processing Module o utilizzare altri software, come Excel o MATLAB per eseguire calcoli che non sono (ancora) incorporati nel Data Processing Module.
  5. Apri il modulo di elaborazione dati, seleziona "Progetto" sulla barra degli strumenti, quindi dal menu a discesa seleziona "Nuovo" e quindi inserisci un nome per l'esperimento. Seleziona "Modifica progetto" sulla barra degli strumenti, seleziona "Aggiungi al progetto" dal menu a discesa, seguito da "Nuovo gruppo" e inserisci un nome per il gruppo (ad es. "Controlli"). Nota, in questo momento i nomi del progetto e del gruppo non sono realmente utilizzati, ma i nomi devono essere compilati. Le cartelle create possono essere utilizzate per memorizzare i file di output (vedere il passaggio 4.10).
  6. Selezionare un gruppo (ad es. "Controlli") nella finestra di destra (vedere la Figura 19). La barra degli strumenti cambierà. Seleziona "Modifica gruppo", quindi "Aggiungi al gruppo" dal menu a discesa, quindi "Nuove misurazioni". Si aprirà un browser. Aprire la cartella creata durante la registrazione (passaggio 2.7), selezionare la sottocartella 'traiettorie' e quindi il file.smoothed. Nell'esempio presentato nella Figura 19, per il Gruppo A sono stati caricati sei file, per il Gruppo B quattro file. (Si noti che nell'esempio illustrato i file levigati hanno le estensioni 0 e 1, perché in quell'esperimento sono stati testati due pesci rossi contemporaneamente).
  7. Per l'analisi, selezionare il file con smussamento dei punti nella finestra di destra, selezionare "Elaborazione dati", selezionare "Endpoint singoli" dal menu a discesa e, ad esempio, selezionare "Congelamento della durata" (Figura 20). Si apre una finestra per specificare il congelamento in termini di soglia di velocità e soglia di durata. Nell'esempio, il pesce trascorre il 25,86% del tempo di osservazione sul congelamento.
  8. Per familiarizzare con il programma, provare altri esempi, come la distanza di viaggio, la distribuzione della profondità (che consente di determinare il numero di livelli di profondità) e la frequenza di burst.
  9. Ci sono calcoli più avanzati, come l'analisi spettrale della componente z dell'accelerazione. In questo caso, selezionare "Caratteristiche delle serie temporali", quindi "Analisi del dominio di frequenza TD", "Analisi spettrale" e "Spettro dell'accele Z". L'analisi di Fourier verrà eseguita sul parametro indicato (per la spiegazione7). Non tutte le opzioni visualizzate nel menu sono ancora completamente implementate. Ad esempio, la "tortuosità del percorso" è stata aggiunta solo sperimentalmente.
  10. Quando si seleziona l'opzione "Elaborazione batch con soglia predefinita", verranno calcolati circa 200 endpoint. In questo contesto, "default" significa che sono stati impostati dei delimitatori. Ad esempio, attualmente la distribuzione della profondità viene calcolata per tre livelli di profondità, la distribuzione angolare viene calcolata per quattro sezioni (ad es. quadranti) ecc. Dopo aver generato i parametri si apre una nuova finestra che chiede la posizione e il nome del file da creare. Questi verranno salvati in formato CSV e potranno essere importati in altri software, come Excel, per un'ulteriore elaborazione.
  11. A differenza del modulo di registrazione e del modulo di traiettoria, il modulo di elaborazione dati è un modulo in evoluzione che verrà ulteriormente adattato alle esigenze dei ricercatori.

Risultati

Zebrafish femmine di sei mesi (Danio rerio) di una ceppa wild-type non specificata ("a pinne corte") sono state acquistate da Aquatica Tropicals, Inc. In totale sono stati utilizzati 120 zebrafish. Sono stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per circa 8 settimane in acquari da 38 L prima di iniziare gli esperimenti. La temperatura dell'acqua corrispondeva alla temperatura ambiente (~23 °C). Regime luminoso: 14 ore di luce (6:00-20:00), 10 ore di buio. Gli zebrafish sono stati alimentati tre volte al giorno: alle 8:00 fiocchi Tetra tropical; alle 12:00 larve vive di artemia; alle 15:00 fiocchi Tetra tropical. Nei giorni degli esperimenti, gli zebrafish sono stati nutriti con fiocchi soltanto alle 8:00. Immediatamente dopo la seconda registrazione, gli zebrafish sono stati eutanasizzati con tricaina metansolfonato (MS-222) alla concentrazione di 300 mg/L.

Per il gruppo di controllo sono stati utilizzati 14 quadrupli (vale a dire gruppi di quattro zebrafish) (n = 14), per il gruppo MK-801 sono stati utilizzati 16 quadrupli (n = 16). Dopo un'esposizione di 1 ora a 10 µM di MK-801 (iniziata alle 9:30) in contenitori da 1 L, i quadrupli sono stati trasferiti nei contenitori di osservazione. La registrazione è iniziata immediatamente (alle 10:30) ed è durata 20 minuti. Successivamente, i pesci zebra sono stati lasciati nei contenitori per 3,5 ore. Durante questo periodo, è stata fornita aerazione tramite un tubo collegato a una pompa d'aria. Alle 14:00 è stata effettuata una seconda registrazione della durata di 20 minuti. L'obiettivo delle due registrazioni era studiare gli effetti dell'abituazione e/o della riduzione degli effetti del farmaco (la emivita del MK-801 nei ratti è di circa 2 ore28). Sono stati analizzati: (1) le distanze sociali medie (chiamate anche distanze inter-individuali11,29) come misura della coesione sociale, (2) la distribuzione verticale su dieci livelli di profondità, (3) la distribuzione orizzontale su quattro zone radiali (vedere Figura 24A, insetto per le posizioni delle zone) e sui quadranti (vedere Figura 24B, insetto per le posizioni dei quadranti), e (4) le tre componenti (x,y,z) della distanza percorsa. I dati sono stati mediati per ogni branco. Dopo aver verificato mediante il test di Shapiro-Wilks che non tutte le variabili fossero distribuite normalmente, sono stati applicati test U di Mann-Whitney per tutte le variabili al fine di confrontare le medie dei gruppi di controllo e MK-801. Questi confronti sono stati effettuati separatamente per le sessioni del mattino e del pomeriggio. È stato adottato un valore di α = 0,05/4 = 0,0125, poiché sono state utilizzate quattro (categorie di) variabili (vedi sopra).

Figura 2A mostra un esempio tipico di fotogramma relativo a zebrafish di controllo e Figura 2B mostra un esempio tipico di fotogramma relativo a zebrafish trattati con MK-801, entrambi registrati durante la sessione mattutina. Si noti che gli zebrafish di controllo si trovavano vicino al fondo, vicino alla parete frontale (ovvero il lato più vicino alla telecamera) e rimanevano strettamente raggruppati (ovvero la coesione sociale era elevata). Al contrario, gli zebrafish trattati con MK-801 si trovavano vicino alla superficie, non mostravano alcuna preferenza nel piano orizzontale e nuotavano a notevole distanza l'uno dall'altro (ovvero la coesione sociale era bassa). Figura 21 mostra traiettorie rappresentative. Gli zebrafish di controllo mostravano una chiara tendenza a rimanere sul lato frontale del contenitore di osservazione. Inoltre, rimanevano per la maggior parte del tempo vicino al fondo. Gli zebrafish trattati con MK-801, invece, nuotavano in qualsiasi posizione del piano orizzontale. Tuttavia, alle 10:30 mostravano una chiara preferenza per i livelli di profondità superiori. Alle 14:00, la loro distribuzione verticale divenne più omogenea.

L'analisi quantitativa dei dati ha confermato la nostra descrizione. Figura 22A mostra che la distanza sociale media (ovvero la distanza inter-individuale media tra i quattro zebrafish dei quadrupletti) nei zebrafish trattati con MK-801 era più di tre volte maggiore rispetto ai zebrafish di controllo durante la mattina (alle 10:30), con U = 0 e p<0,00001. Dopo un'abituazione di 3,5 ore (alle 14:00), la distanza sociale nei zebrafish di controllo è aumentata, mentre è rimasta pressoché invariata nei zebrafish trattati con MK-801. Tuttavia, è rimasta significativamente diversa tra i due gruppi (U = 19, p<0,0005). Figura 22B mostra le linee temporali della distanza sociale per i due gruppi sperimentali sia alle 10:30 che alle 14:00.

La distribuzione verticale era anche molto diversa per entrambi i gruppi. Figura 23 mostra che sia al mattino (10:30) che nel pomeriggio (14:00), i zebrafish di controllo trascorrevano la maggior parte del tempo nei due o tre livelli di profondità più bassi (ovvero i livelli più vicini al fondo del contenitore di osservazione). Gli zebrafish trattati con MK-801, invece, nuotavano per la maggior parte del tempo vicino alla superficie dell'acqua alle 10:30 (Figura 23A). Dopo 3,5 hr di abituazione, alle 14:00 erano distribuiti più o meno uniformemente su tutti i livelli di profondità.

La distribuzione orizzontale era anche molto diversa per entrambi i gruppi sperimentali. In Figura 24A si osserva che i zebrafish trattati con MK-801 hanno trascorso meno tempo nella zona esterna e più tempo nelle zone centrale e intermedia rispetto ai zebrafish di controllo. Le differenze tra i gruppi riguardo ai quadranti erano ancora più evidenti (Figura 24B). I zebrafish di controllo mostravano una marcata preferenza per i due quadranti anteriori (1 e 4), cioè il lato del contenitore più vicino alla telecamera. I zebrafish trattati con MK-801, al contrario, erano distribuiti più o meno uniformemente nei quattro quadranti.

Per quanto riguarda i parametri cinematici, limitiamo la discussione alla distanza percorsa (Figura 25). I zebrafish trattati con MK-801 si sono mossi di più rispetto ai zebrafish di controllo. In modo particolare, tale differenza è risultata significativa per la componente y della distanza percorsa, ovvero la direzione della telecamera (vedere Figura 1). Di fatto, i zebrafish di controllo sono rimasti per la maggior parte del tempo vicino alla parete frontale nei quadranti 1 e 4 (come mostrato nelle Figure 24A e 24B). Al contrario, i zebrafish trattati con MK-801 si sono spostati avanti e indietro tra la metà anteriore e posteriore del contenitore.

Qui abbiamo presentato solo un esempio dei possibili modi per analizzare i dati forniti dall'esperimento. A questo punto, ci asteniamo dall'attribuire un'interpretazione biologica specifica ai risultati. Tuttavia, vale la pena menzionare che il MK-801 è stato trovato indurre ritiro sociale30 e ridurre i comportamenti investigativi sociali nei ratti31 ed è stato studiato come modello per i sintomi negativi della schizofrenia30. Ha inoltre causato iperattività31, comportamento circolare32, deficit sensoriali33 e riduzione dell'inibizione del prepulso34 nei mammiferi. Sebbene non abbiamo testato specificamente questi deficit, i nostri risultati sembrano essere coerenti con essi. Sono necessarie configurazioni sperimentali più specifiche per determinare se gli effetti descritti del MK-801 nel pesce zebra siano paragonabili a quelli descritti nei mammiferi. Sarebbero inoltre necessarie ulteriori analisi e esperimenti per stabilire se ansia, problemi respiratori, disorientamento spaziale, deficit attentivo, stereotipie ecc. abbiano avuto un ruolo significativo nei comportamenti alterati indotti dal MK-801 nel pesce zebra.

Schema del setup di misurazione ottica con fotocamera, computer, cubo e specchio; studio fotonico
Figura 1. Schema dell'apparato sperimentale. La fotocamera acquisisce fotogrammi (ovvero immagini fisse) che mostrano sia la vista frontale che quella superiore del serbatoio di osservazione. I fotogrammi vengono memorizzati nel computer per ulteriori elaborazioni. Si notino le posizioni delle dimensioni xyz, fondamentali per descrivere le caratteristiche tridimensionali dei movimenti e delle posizioni dei zebrafish. I due lati ombreggiati della figura (e il fondo del serbatoio) sono stati nel nostro esperimento (vedi Risultati Rappresentativi) dipinti di bianco, mentre gli altri due lati erano trasparenti. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Esperimento sul comportamento in acquario, due acquari con distribuzione dei pesci, configurazione dello studio comportamentale.
Figura 2. Esempi di fotogrammi. Si noti che le viste frontali o superiori, prese singolarmente, comportano una perdita di informazioni. Questo è particolarmente evidente nel pannello B, dove i tre zebrafish a sinistra sembrano essere molto vicini l'uno all'altro osservando la vista frontale, mentre la vista dall'alto mostra che ciò non corrisponde al vero. D'altro canto, la vista dall'alto non fornisce alcuna indicazione sulla distanza dal fondo. A) Zebrafish di controllo. B) Zebrafish trattati con 10 µM di MK-801. Si noti che il colore (blu) dello sfondo è stato generato dal software di registrazione ed è stato scelto per ottenere un buon contrasto. Il colore reale delle pareti posteriore e laterale destra e del fondo era bianco. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Sistema di tracciamento del comportamento di animali acquatici; configurazione dell'analisi video; pannello di calibrazione; processo di monitoraggio.
Figura 3. Allineamento dello specchio laterale. La freccia bianca a sinistra indica la parete frontale (più vicina alla telecamera) nello specchio laterale. Se sono visibili due linee, correggere la posizione dello specchio laterale finché ne risulta visibile soltanto una (passaggio 1.2). I 5 LED del pannello di calibrazione sono chiaramente visibili in tutte e tre le viste. Si noti che, poiché le luci nella camera sono accese, sul pannello LED si osservano molte altre riflessioni (passaggio 1.4). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Processo di rilevamento delle particelle, riquadri rossi, diagramma di analisi ottica, condizioni di scarsa illuminazione.
Figura 4. Marcatura dei LED. Nel pannello di sinistra si osserva che i cinque marcatori (numerati da 0 a 4) identificati tramite la procedura di calibrazione non corrispondono ai LED effettivi. Oltre ai LED, sono visibili altri punti luminosi (in realtà riflessi). Nel pannello di destra, guadagno e tempo di esposizione sono stati ridotti in modo che risultino visibili soltanto i LED. A questo punto, i cinque marcatori vengono assegnati correttamente (come descritto nei passaggi 1.7-1.10). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Interfaccia del software di tracciamento del comportamento di animali acquatici che mostra il controllo della telecamera e l'impostazione della calibrazione.
Figura 5. Raccogli le informazioni sul contenitore. Viene mostrata la sequenza dei sei punti da selezionare (facendo clic con il tasto destro del mouse). Le linee verranno disegnate automaticamente. Si noti che i numeri indicati qui non appaiono sullo schermo. Al termine, premere 'Raccogli le informazioni sul contenitore' (come descritto al passo 1.12). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Diagramma dell'esperimento di idrodinamica; configurazione del serbatoio per dinamica dei fluidi e galleggiamento; componenti annotati.
Figura 6. Volume da raccogliere. Fare clic con il tasto destro del mouse sulle posizioni indicate che segnano gli angoli del corpo idrico: prima segnare l'angolo nella vista frontale e poi nella vista dall'alto. Procedere quindi con l'angolo successivo (da 1 a 8). Si noti che gli otto punti delimitano il contorno del corpo idrico, non quello del serbatoio. Si osservi inoltre che, quando si fa clic con il tasto destro del mouse, appare solo 'x0', che scomparirà nuovamente quando si fa clic sul punto successivo (pertanto i numeri da 1 a 8 non compaiono effettivamente sullo schermo). La procedura è descritta al punto 1.17. Cliccare qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Impostazione per il tracciamento del comportamento di animali acquatici con controllo della telecamera, monitoraggio del movimento degli animali nell'acquario.
Figura 7. Contrasto non corretto. L'immagine è sovraesposta e il contrasto tra il pesce e lo sfondo (soprattutto nella vista frontale) è basso. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Impianto acquatico con pesci utilizzati nello studio dell'equilibrio statico; esperimento in dinamica dei fluidi.

Figura 8. Contrasto corretto. Il contrasto è ora migliorato rispetto alla Figura 7. Si noti che i colori sullo schermo sono colori falsi. Cliccare qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Interfaccia delle impostazioni della fotocamera per Bumblebee2 BB2-03S2C, che mostra le regolazioni di luminosità, esposizione e saturazione.
Figura 9. Impostazioni generali. Dopo aver selezionato 'Controllo fotocamera' nel menu principale, si apre la finestra 'Impostazioni generali'. Deselezionare le caselle 'Shutter' e 'Gain' e utilizzare i cursori per trovare il contrasto migliore tra il pesce e lo sfondo. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Interfaccia grafica per la regolazione del bilanciamento del bianco della telecamera; cursori rosso/blu; ottimizzazione dell'elaborazione delle immagini
Figura 10. Impostazioni del colore. Nella finestra «Bilanciamento del bianco/Colore» deselezionare la casella «Auto» e utilizzare i cursori «Rosso» e «Blu» per trovare la combinazione migliore che garantisca un buon contrasto tra il pesce e lo sfondo. Parametri. Dopo aver aperto il Modulo traiettoria, selezionare il file sperimentale con «Posizione dati» e quindi aprire la finestra «Parametri» con «Configurazione sistema». In questa fase vengono assegnati dei valori iniziali appropriati ai parametri. Cliccare qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Interfaccia del software di tracciamento del comportamento di animali acquatici; parametri di calibrazione; configurazione dell'analisi video.
Figura 11. Parametri. Dopo aver aperto il Modulo di Traiettoria, selezionare il file sperimentale con 'Posizione dati' e quindi aprire la finestra 'Parametri' tramite 'Configurazione del sistema'. A questi parametri vengono assegnati qui dei valori iniziali adeguati. .Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Impostazione per il tracciamento del comportamento acquatico, calibrazione del sistema 3D, interfaccia software, analisi delle traiettorie.
Figura 12. Allineamento della scatola. Osservare come le scatole rosse per la vista dall'alto e quella frontale definiscano le aree in cui potrebbe trovarsi il pesce. La scatola a sinistra è ridotta a una linea per escludere questa zona dalla ricerca. Cliccare qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Interfaccia del software di tracciamento degli animali acquatici, che mostra l'allestimento per la calibrazione e il monitoraggio per l'analisi del comportamento.

Figura 13. Assegnazione dei tag. Dopo aver premuto il pulsante "Inizia a generare le traiettorie" e aver scelto il fotogramma iniziale (normalmente il fotogramma n. 0), si apre la finestra "Assegnazione dei tag". Premere "Avanti" fino a quando il tag ("X0") appare sullo schermo. Se il tag non è posizionato correttamente sull'immagine del pesce, premere "No" finché non viene posizionato in modo corretto. Successivamente, premere "Vai". Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Diagramma di analisi dinamica con vettore della forza, concentrazione di sollecitazione; componenti etichettati A, B.
Figura 14. Schermata informativa. Il pannello (A) mostra l'assegnazione corretta dell'etichetta. L'etichetta ('X0') è posizionata sull'immagine del pesce in entrambe le viste. Di solito una linea attraversa l'etichetta. Il pannello (B) mostra un rumore eccessivo e l'assenza di assegnazione dell'etichetta. I fotogrammi sono stati acquisiti dalla stessa registrazione modificando le soglie di colore e dimensione (al passaggio 2.2) rispettivamente da 1.000-50 a 10-5. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Analisi della traiettoria 3D, diagramma vettoriale che illustra il movimento delle particelle in coordinate cartesiane.
Figura 15. Rappresentazione tridimensionale del percorso ricostruito. L'origine delle frecce si trova all'angolo anteriore sinistro della vasca, a scopo orientativo (vedere anche Figura 1). In questo esempio, quindi, il pesce rimane vicino alla parete sinistra (rispetto alla telecamera). Cliccare qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Finestra di impostazione dei parametri per la levigatura delle traiettorie; impostazioni del filtro: soglie di rumore, dimensione della finestra.
Figura 16. Levigatura delle traiettorie. Questa finestra si apre dopo aver premuto il pulsante 'Levigatura delle traiettorie'. Per il momento, accettare il valore predefinito premendo 'OK'. Cliccare qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

File organization diagram showing data transfer from "fish1" folder to "Trajectories" subfolder.
Figura 17. Sottocartelle. La cartella generata durante la registrazione è mostrata sopra. Dopo la ricostruzione del percorso, contiene le sei sottocartelle indicate. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Dati numerici in formato testuale per l'analisi statistica.
Figura 18. File smussato. Nella parte superiore è mostrato un esempio di file point.smoothed, che indica il numero di fotogrammi, la durata della registrazione (in min), le coordinate del centro del corpo idrico rispetto alla telecamera e, per ogni fotogramma, le coordinate e la durata. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Interfaccia del software per l'elaborazione dati per l'analisi dei dati di traiettoria; configurazione del progetto e assegnazione dei gruppi.
Figura 19. Elaborazione dei dati. Selezione dei file da analizzare (finestra a destra). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Interfaccia di elaborazione dati 3D ABMT che mostra l'allestimento dell'analisi di congelamento per la valutazione delle traiettorie.
Figura 20. Esempio di analisi. I punti finali di interesse possono essere calcolati selezionandoli dal menu. In questo esempio è stato selezionato 'Durata del congelamento'. Il programma richiede di inserire delle soglie di velocità e durata che definiscano il congelamento. Il risultato viene espresso in percentuale della durata totale della registrazione. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Diagramma dell'analisi della locomozione, percorsi di tracciamento in pesci controllo e trattati con MK-801 nel tempo.
Figura 21. Traiettorie rappresentative. Sono mostrate due traiettorie rappresentative per i pesci zebra di controllo e due traiettorie rappresentative per i pesci zebra trattati con MK-801 10 µM, relative alla sessione mattutina che inizia alle 10:30 (riga superiore) e alla sessione pomeridiana che inizia alle 14:00 (riga inferiore). Le traiettorie dei singoli pesci zebra di ogni quadrupletto sono rappresentate con colori diversi. Tuttavia, si noti che potrebbe essersi verificato uno scambio di etichette. È necessaria una correzione manuale se risulta fondamentale seguire le singole traiettorie. Il lato anteriore sinistro (origine delle frecce inserite) del contenitore raffigurato è il lato più vicino alla telecamera (vedere Figura 1 per la posizione della vasca). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Analisi della distanza sociale; grafico; effetto del controllo rispetto a MK-801; risultati comparativi delle sessioni; serie temporale.
Figura 22. Distanza sociale media tra i pesci. A) Le distanze sociali medie per i zebrafish di controllo e per i zebrafish trattati con 10 µM MK-801 sono riportate per le sessioni del mattino e del pomeriggio. Sono mostrati la media e l'errore standard della media (S.E.M.). ***, p<0.001. B) Le linee temporali della distanza media inter-individuale sono riportate per entrambi i gruppi. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Analisi della profondità; grafico multivariato; confronto tra controllo e MK-801; percentuale del tempo rispetto ai livelli di profondità.
Figura 23. Distribuzione per profondità. A) Distribuzione dei zebrafish su dieci livelli di profondità uguali (dove il livello 1 è il livello più vicino al fondo) per la sessione mattutina. B) Distribuzione dei zebrafish per la sessione pomeridiana. Sono riportati media e errore standard della media (S.E.M.). *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Grafico della proporzione temporale per zona radiale e quadrante; analisi dei dati; risultati dell'esperimento psicologico.
Figura 24. Distribuzioni orizzontali. (A) Viene presentata la distribuzione temporale nei quattro settori radiali dei gruppi sperimentali. L'insetto mostra la posizione dei settori dal centro verso la periferia: settore centrale, medio, esterno e settori angolari combinati. (B) Viene presentata la distribuzione temporale nei quattro quadranti dei gruppi sperimentali. L'insetto mostra la posizione dei quadranti. Le pareti indicate con linee doppie rappresentano pareti bianche, quelle indicate con linee singole rappresentano pareti trasparenti. La telecamera si trova a sinistra dell'insetto, i.e. più vicina ai quadranti 1 e 4 (vedere anche Figura 1). Sono riportati media e errore standard della media (S.E.M.). Gli asterischi neri indicano i confronti tra i gruppi per la sessione mattutina e gli asterischi grigi quelli per le sessioni pomeridiane: *, p<0.0125; **, p<0.005; ***, p<0.001. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Grafico di equilibrio statico; distanza percorsa rispetto alle coordinate; controllo rispetto a MK-801; analisi dei dati.
Figura 25. Distanza percorsa. Sono mostrati i componenti xyz della distanza percorsa dai pesci zebra durante le sessioni mattutine e pomeridiane. Sono riportati la media e l'errore standard della media (S.E.M.). Gli asterischi neri indicano i confronti tra i gruppi per la sessione mattutina e gli asterischi grigi per le sessioni pomeridiane: *, p<0.0125; ***, p<0.001. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Discussione

La procedura sperimentale qui mostrata consente di registrare singoli pesci zebra, coppie di pesci zebra (ad esempio per studiare l'accoppiamento o l'aggressività) e banchi di pesci zebra (come mostrato nell'esempio rappresentativo). Il sistema è particolarmente adatto per ottenere contemporaneamente informazioni sulla distribuzione 3D (verticale e orizzontale), sulle caratteristiche cinematiche (ad es. velocità, accelerazione, angolo di sterzata) e sui parametri sociali (ad es. coesione sociale). Di seguito, elenchiamo alcune questioni importanti da considerare quando si pianificano gli esperimenti.

A seconda della procedura sperimentale, possono essere studiati diversi sistemi comportamentali. Ad esempio, per esplorare la neofobia (cioè la paura per nuovi ambienti) la registrazione dovrebbe essere avviata immediatamente dopo aver introdotto il pesce zebra nella vasca di osservazione (dopo aver aspettato solo pochi secondi che l'acqua si calmasse per diminuire il rumore), senza previa assuefazione11,17,37. D'altra parte, alcuni argomenti di ricerca potrebbero richiedere che il pesce zebra sia ben abituato, ad esempio quando si studiano gli effetti dei feromoni di allarme16. Quando si studiano gruppi di pesci zebra, lo sperimentatore dovrebbe essere consapevole che, sebbene il software riduca al minimo il cambio di tag, in questo momento non è possibile seguire i singoli pesci zebra per tutto il tempo. Anche questo non è importante per gli studi di branco in cui l'enfasi è sulla coesione sociale, ma sarebbe cruciale quando si esplora l'aggressività o l'accoppiamento. La riassegnazione manuale dei tag è un'opzione, ma può richiedere molto tempo.

Il colore delle pareti del contenitore di osservazione e della camera di osservazione può avere una grande influenza sul comportamento del pesce zebra. Ad esempio, è stato descritto che le pareti bianche inducono risposte di avversione36, 37. Quando provi colori diversi, tieni a mente due cose: 1) è importante che la parete frontale (cioè la parete più vicina alla telecamera) rimanga trasparente e che anche un coperchio (se ne viene utilizzato uno) deve essere trasparente; 2) Quando si seleziona un colore mai utilizzato prima, determinare prima se il contrasto tra zebrafish e sfondo è appropriato per la registrazione. Eseguire un test. La modifica delle impostazioni della fotocamera per la registrazione (guadagno, otturatore, rosso e blu, come spiegato nei passaggi 2.5 e 2.6) e delle impostazioni per la ricostruzione della traiettoria (ad esempio, le soglie di colore e dimensione, come spiegato nei passaggi 3.3, 3.5, 3.11 e 3.12) può fare una grande differenza. Ancora una volta, l'esperienza con il sistema farà molto per decidere cosa è possibile.

A seconda dello scopo dell'esperimento, potrebbe essere desiderabile una sorgente luminosa con caratteristiche diverse (ad es. spettro, intensità). Le barre LED possono essere facilmente sostituite. Assicurati che la luce raggiunga ogni parte del contenitore.

Se l'esperimento richiede che il pesce zebra rimanga nel contenitore di osservazione per diverse ore, assicurarsi di fornire aerazione. Un tubo dell'aria può essere fissato all'angolo posteriore destro utilizzando una clip. Verificare sullo schermo del computer che la clip non interferisca con la registrazione, ad es. che il pesce zebra non è mai nascosto alla vista. Nelle figure 2A e 2B la clip nera può essere vista nella vista dall'alto. Idealmente, l'aerazione dovrebbe essere fornita prima o tra le registrazioni, ma non durante la registrazione per evitare rumore. Si noti inoltre che l'attivazione o la disattivazione di una forte aerazione potrebbe spaventare il pesce zebra.

Se l'esperimento richiede di tenere il pesce zebra nel contenitore per tutta la notte, è utile coprire la camera di osservazione con un coperchio trasparente per evitare che il pesce zebra salti fuori (che è un evento molto comune). Se il coperchio non viene rimosso prima della registrazione (per non disturbare il pesce zebra), considerare i seguenti due punti: 1) assicurarsi che le immagini speculari delle sorgenti luminose non ostruiscano la registrazione (ad esempio spostando le sorgenti luminose o scegliendo un coperchio che rifletta la luce solo in minima parte); 2) considerare che il coperchio potrebbe appannarsi se utilizzato durante la notte, tanto più che in questo caso deve essere prevista anche l'aerazione; Un modo per ridurre questo problema è scegliere un coperchio con piccoli fori.

Per alcuni esperimenti potrebbe essere essenziale determinare il comportamento di base del pesce zebra prima di somministrare un farmaco. In questo caso, il farmaco può essere aggiunto tra una sessione e l'altra per mezzo di un tubo (simile al tubo di aerazione discusso sopra).

Sebbene l'attenzione si sia concentrata sulla registrazione del pesce zebra (Danio rerio), anche altre specie ittiche possono, naturalmente, essere registrate con il sistema. È stato utilizzato per studiare i comportamenti dei pesci rossi (giovani) (Carassius auratus), del barbo tigre (Barbus tetrazona) e della coda di spada verde (Xiphophorus helleri).

Infine, va notato che sono principalmente possibili altre dimensioni delle vasche di osservazione. Tuttavia, sarebbe necessario riconfigurare il sistema e trovare un buon equilibrio tra risoluzione spaziale e temporale quando si utilizzano contenitori di osservazione molto più grandi. Inoltre, la forma del contenitore deve essere cuboide. Il numero di zebrafish o di altri soggetti sperimentali è teoricamente illimitato; Tuttavia, lo scambio di tag aumenta con il numero di soggetti.

Dichiarazioni

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu e Wei Weng sono dipendenti di xyZfish, Ronkonkoma NY, che produce il sistema di tracciamento utilizzato in questo articolo.

Ringraziamenti

Gli autori non hanno riconoscimenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Hardware di tracciamento AABT-3DxyZfishAABT IIInclude fotocamera, scheda video, scomparto di osservazione con specchio e illuminazione
AABT-3D Attrezzatura di calibrazionexyZfishcalibContiene pannello di calibrazione e specchio laterale
AABT-3D Contenitori di osservazione cubixyZfish 
AABT-3D Software di tracciamentoxyZfishv.1.0 
ComputeropzionaleN/AWindows XP o superiore
(+)-MK-801 maleato di idrogenoSigmaM107 
Pompa ad ariaFusion500 
Tubo linea aria 3/16"Lee' s Prodotti per acquari e animali domestici14508 
Clip per raccoglitori mediOfficeDepot561339Per collegare la linea aerea al contenitore di osservazione

Riferimenti

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