Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Summary

Phage display è una tecnica potente per catturare proteine ​​o porzioni di proteine ​​che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori.

Abstract

Utilizzando fago ricombinante come impalcatura per presentare varie porzioni di proteine ​​codificate da una libreria di cDNA clonato direzionalmente a molecole esca immobilizzate è un mezzo efficace per scoprire le interazioni. La tecnica è stata ampiamente utilizzata per individuare le interazioni proteina-proteina, ma la molecola esca per essere messo in discussione non deve essere limitata alle proteine. Il protocollo qui presentato è stato ottimizzato per consentire un modesto numero di esche da sottoporre a screening in replicati per massimizzare l'identificazione di cloni indipendenti che presentano la stessa proteina. Ciò consente una maggiore fiducia che le proteine ​​che interagiscono individuate sono interattori legittimi della molecola esca. Monitoraggio del titolo fago dopo ogni selezione affinità fornisce rotonda informazioni sulla selezione di affinità sta procedendo nonché sull'efficacia dei controlli negativi. Uno dei mezzi per la titolazione del fago, e come e cosa preparare in anticipo per consentire a questo processo di progredire nel modo più efficientepossibile, è presentato. Attributi di ampliconi recuperati previo isolamento della placca indipendente sono evidenziate che può essere utilizzata per determinare quanto bene la selezione di affinità è progredita. Difficoltà tecniche per ridurre al minimo i falsi positivi o per aggirare persistente recuperare fago riprese sono spiegato. Mezzi di ridurre la contaminazione virale divampare sono discussi.

Introduction

Perché usare phage display e la selezione affinità invece della miriade di altre tecniche disponibili per la scoperta e lo studio delle interazioni proteina con altre molecole? Phage display può vantare alcuni vantaggi unici rispetto ad altri metodi di rilevazione di interazioni proteina-ligando ^1-3, tra cui i seguenti:

Molto ampio repertorio di molecole esca

Il motivo principale è nella diversità delle molecole in grado di agire come esca nella selezione affinità ^4. Phage display è un potente mezzo di isolare frammenti di proteine ​​che interagiscono con altre proteine, nucleotidi, carboidr....

Protocol

Una rappresentazione grafica la procedura descritta di seguito (Figura 1) evidenzia le due componenti principali per la selezione di affinità utilizzando una libreria fagica: A) una libreria di cDNA phage display probabilità di codificare proteine ​​con affinità per l'esca e, B) un esca ricombinante purificata proteina. Produzione di esche (proteina ricombinante) è stato ampiamente esaminato e letteratura che illustra le migliori pratiche per la protezione solubile, proteina ricombinante attivo da E. coli ^12-13, lievito eucariotica ^14, insetto ^{15-16, 17-18} pianta, o mammiferi ^19-20 cellule abbo....

Results

Potendo compromettere la capacità del esca per interagire con le proteine ​​fagiche-visualizzata (metabolicamente avvelenare l'esca) fornisce un controllo negativo potente per questa tecnica. E 'inoltre consigliabile determinare se l'esca, quando si lega al micropiastra bene, mantiene la sua funzione. Entrambi questi controlli aumenterà la fiducia che interagiscono, proteine ​​fago-visualizzato recuperati dal esca nonpoisoned sono legittime.

Campionamento tre triplicato da ciascun pozzetto a.......

Discussion

Eseguendo l'esperimento in tre pozzi replicate, fago acquisito indipendentemente vincolante all'esca stessa proteina può essere distinto anche se sono lo stesso clone (cioè nessuna differenza nella sequenza nucleotidica della regione CDS che è stata acquisita ma questi sono stati recuperati dai pozzi indipendenti). Altrimenti, l'unico modo per distinguere tra fago codifica vincolante per l'esca stessa proteina è se sono indipendentemente invertire regioni trascritte che differiscono in qualche p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.
Estratto di lievito	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	BP358-10
Agarosio	Research Products International	A20090
Reagente bloccante	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20 Fisher	Scientific	BP337-100
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	BP359-212
Sodio dodecil solfato	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Cloroformio	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotipo: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillina, Sodium Salt	Research Products International	A40040
Bromuro di etidio	Fisher Scientific	BP102-1
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS anticorpo primario	Qiagen Inc.	34660
Capra coniugato di fosfatise alcalina anti-topo	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrofenilfosfato	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP primer	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
primer	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Kit
purificazione PCR Qiaquick	Inc.	28104
Qiaquick Kit di estrazione del gel	Qiagen Inc.	28706
Kit di sequenziamento del ciclo Big Dye Terminator v3.1	Invitrogen Life Technologies	4336917
Blocco riscaldante	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti	Corning	Costar 3590
Isotemp Incubator Oven Fisher	Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Guanti, Nitrile	Fisher Scientific	19-170-010C
Provette sterili da 1,5 ml	USA Scientific Inc	1615-5500
Pipette in borosilicato da 10 ml	Fisher Scientific	13-678-25E
Provette per coltura in borosilicato	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, lettore di piastre ELISA	Labsystem e Flow Laboratories, Helsinki, Finlandia	Tipo 362