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Articolo metodologico

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

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DOI:

10.3791/50685

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16 febbraio 2014

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

In questo articolo

Sommario

Phage display è una tecnica potente per catturare proteine ​​o porzioni di proteine ​​che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori.

Abstract

Utilizzando fago ricombinante come impalcatura per presentare varie porzioni di proteine ​​codificate da una libreria di cDNA clonato direzionalmente a molecole esca immobilizzate è un mezzo efficace per scoprire le interazioni. La tecnica è stata ampiamente utilizzata per individuare le interazioni proteina-proteina, ma la molecola esca per essere messo in discussione non deve essere limitata alle proteine. Il protocollo qui presentato è stato ottimizzato per consentire un modesto numero di esche da sottoporre a screening in replicati per massimizzare l'identificazione di cloni indipendenti che presentano la stessa proteina. Ciò consente una maggiore fiducia che le proteine ​​che interagiscono individuate sono interattori legittimi della molecola esca. Monitoraggio del titolo fago dopo ogni selezione affinità fornisce rotonda informazioni sulla selezione di affinità sta procedendo nonché sull'efficacia dei controlli negativi. Uno dei mezzi per la titolazione del fago, e come e cosa preparare in anticipo per consentire a questo processo di progredire nel modo più efficientepossibile, è presentato. Attributi di ampliconi recuperati previo isolamento della placca indipendente sono evidenziate che può essere utilizzata per determinare quanto bene la selezione di affinità è progredita. Difficoltà tecniche per ridurre al minimo i falsi positivi o per aggirare persistente recuperare fago riprese sono spiegato. Mezzi di ridurre la contaminazione virale divampare sono discussi.

Introduzione

Perché usare phage display e la selezione affinità invece della miriade di altre tecniche disponibili per la scoperta e lo studio delle interazioni proteina con altre molecole? Phage display può vantare alcuni vantaggi unici rispetto ad altri metodi di rilevazione di interazioni proteina-ligando 1-3, tra cui i seguenti:

Molto ampio repertorio di molecole esca

Il motivo principale è nella diversità delle molecole in grado di agire come esca nella selezione affinità 4. Phage display è un potente mezzo di isolare frammenti di proteine ​​che interagiscono con altre proteine, nucleotidi, carboidrati, ecc 5 In sostanza, se un polimero / molecola può essere attaccato ad un supporto recuperabile, può essere schermato per affinità con le proteine ​​fagiche visualizzati. Inoltre, la molecola esca può accedere per determinare se esso mantiene l'attività biologica quando immobilizzato 6, se le condizioni usati per reduce / eliminare la sua attività sono efficaci o 6, per introdurre modificazioni post-traslazionali per l'esca prima selezione affinità.

Fago resistenza a fattori esterni

Una seconda ragione per usare phage display, è che è possibile che alcune esche possono richiedere stress ambientale (calore, elevate concentrazioni osmolyte, cofattori specifici, etc.) Per catturare le proteine ​​interagenti, o le proteine ​​indicate nel fago può essere necessario qualche modo alterato prima della selezione di affinità. Il fattore primario di essere studiati rappresenta l'interazione tra esca e proteine, non la condizione che consente l'interazione si verifichi o se non è letale per l'organismo di prova. Il fago T7 è particolarmente adatto per tali studi perché può sopportare condizioni sperimentali difficili sia intatto e vitali (ad esempio il massimo termico pubblicato per vitalità T7 è ~ 60 ° C 7). Come esempio di alterazione fago visualizzata proproteine, nell'esaminare il proteoma seme Arabidopsis thaliana per substrati proteici del enzima di riparazione, Proteina Isoaspartyl metile Transferease (PIMT), il virus utilizzato in questi studi era stato "invecchiato" per una settimana, prima di ogni selezione affinità turno, per favorire l'introduzione di isoaspartate (isoAsp) residui di proteine ​​sensibili 6 che non è possibile negli organismi in grado di riconoscere e riparare / metabolizzare tali anomalie.

Metabolicamente inerte

Inoltre, il fago sono solitamente resistenti ai veleni metabolici e interferire piccole molecole che, almeno, provocare effetti pleiotropici sugli organismi di prova metabolicamente attive. Seguendo i lavaggi di stringenza, il veleno viene rimosso prima che una grande quantità di batteri vengono introdotti per infezione così il veleno viene diluita ad una gamma innocuo per i batteri o successiva replica fago. Mentre indaga bersagli proteici della riparazione PIMTenzima, S-adenosil metionina (AdoMet) è stato utilizzato per attivare l'enzima micro-titolo-piastra-ben immobilizzato per consentire di cattura della proteina bersaglio mentre si basa su S-adenosil omocisteina (AdoHcy) per inattivare l'enzima e fornire un controllo negativo utile fissare in la consapevolezza che il virus non essere negativamente influenzata da una AdoMet o AdoHcy 6. Inoltre, membri di alcune famiglie embriogenesi Dopo abbondante (LEA) proteine ​​indagate in questo laboratorio, sono noti per alterare la loro forma in presenza di additivi come saccarosio 8, che possono raggiungere concentrazioni fino a 200 mm di semi di soia al punto di maturità fisiologica 9. Il virus non è previsto per essere influenzato da aggiunta di saccarosio di 200 mm in ogni round di selezione per affinità, forse necessario per alcune interazioni proteina LEA-client, che non è il caso per gli organismi di prova autonomamente vitali 10.

Questo laboratorio si è concentrata sulla discovering interazioni proteina-proteina in maturi, i semi disidratati o germinazione che sono alla base del meccanismo di protezione proteoma immagazzinata durante la disidratazione 11 o la riparazione dei componenti del proteoma memorizzata che sono sensibili alla formazione isoAsp una volta che il seme ha assorbito 6. Così, la produzione e purificazione di proteine ​​ricombinanti richiesti come esca in uno stato attivo, e garantendo che rimangano così, prima e dopo che sono immobilizzati, anche se spesso difficile, è un elemento fondamentale per il nostro lavoro. Tuttavia, come ogni scenario di produzione di proteine ​​ricombinanti è diversa, le condizioni di ottimizzazione per la produzione di proteine ​​ricombinanti non verranno affrontati qui. Gli utenti sono invitati a tentare, ove possibile, per determinare se la proteina immobilizzata è ancora funzionante (ad esempio se si tratta di un enzima, fare un test enzimatico nei pozzetti di micropiastre). Questo fornirà una certa sicurezza che l'esca è biologicamente attivo e, pertanto, che eventuali interazioni scoperti sonoalquanto più probabilità di avere rilevanza biologica.

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Protocollo

Una rappresentazione grafica la procedura descritta di seguito (Figura 1) evidenzia le due componenti principali per la selezione di affinità utilizzando una libreria fagica: A) una libreria di cDNA phage display probabilità di codificare proteine ​​con affinità per l'esca e, B) un esca ricombinante purificata proteina. Produzione di esche (proteina ricombinante) è stato ampiamente esaminato e letteratura che illustra le migliori pratiche per la protezione solubile, proteina ricombinante attivo da E. coli 12-13, lievito eucariotica 14, insetto 15-16, 17-18 pianta, o mammiferi 19-20 cellule abbondano.

Nella seguente protocollo, un hexahistidyl etichettato proteina ricombinante è stata utilizzata come esca. Ciò consente di verificare che le proteine ​​esca rimangono nei pozzetti dopo incubazione e lavaggio passaggi durante la notte.

1. ELISA per ricombinante Retention proteine ​​nelle Wells Micropiastra

  1. Mark unmicropiastra con inchiostro indelebile, e designato pozzi che conterranno quali concentrazioni di proteine. Eseguire questa in 3 repliche di pozzi. Include 3 repliche di una serie concentrazione controllo negativo (proteina-non-hexahistidyl tagged; BSA funziona bene come questo background check).
  2. Lavare la piastra a lungo con acqua e rimuovere l'acqua dal schioccando la piastra capovolta su 4 strati di carta assorbente tra i lavaggi.
  3. Immobilizzare, nei primi 3 pozzi, in 100 ml di Tris, pH 7,5, (o tampone di scelta) la più alta concentrazione della proteina ricombinante (10 pg / ml). Aggiungere alle successive tre pozzi proteina ricombinante a (1,0 mcg / ml), ecc, fino a 1,0 ng / ml. Fate lo stesso con la serie di concentrazione di BSA.
  4. Coprire i piatti con pellicola trasparente e lasciare per una notte a 4 ° C.
  5. La mattina successiva, rimuovere proteina schioccando piatto capovolto il 4-5 strati tovagliolo di carta.
  6. Lavare i pozzetti 5x con 200 microlitri 1x TBS ogni volta, lasciando il buffernei pozzetti di ~ 1 min ogni volta e rimuovendo il lavaggio buffer schioccando la piastra capovolta su carta assorbente dopo ogni lavaggio.
  7. Bloccare la piastra ELISA su un agitatore rotante con 200 microlitri 5% (w / v) BSA o 200 microlitri 5% (w / v) reagente bloccante in TBS a temperatura ambiente per 2 ore (o seduta overnight stazionario a 4 ° C se conveniente ) avvolto in pellicola trasparente.
  8. Rimuovere la soluzione bloccante eccesso schioccando la piastra capovolta su carta assorbente. Lavare 4x 1 min ogni volta con 200 ml di 1x TBS, rimuovendo la soluzione di lavaggio da schioccando la piastra capovolta.
  9. Diluire penta-HIS anticorpo primario 1/2, 000 in tampone bloccante e consegnare 100 microlitri in ciascun pozzetto. Incubare 1-2 ore a temperatura ambiente con la piastra fissa.
  10. Rimuovere l'anticorpo primario schioccando la piastra capovolta su carta assorbente. Lavare 4x 1 min ogni volta con 200 ml di 1x TBST. Rimuovere ogni lavaggio dal schioccando la piastra capovolta.
  11. Diluire l'anticorpo secondario(Capra anti-topo coniugato di fosfatasi alcalina), in tampone bloccante e incubare 100 microlitri in ciascun pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente con il fermo piastra.
  12. Rimuovere l'anticorpo secondario schioccando la piastra capovolta su carta assorbente. Lavare 4x 1 min ogni volta con 200 ml di 1x TBST. Rimuovere ogni lavaggio dal schioccando la piastra capovolta.
  13. Mettere 200 ml di para-nitrofenilfosfato (pNPP) soluzione di substrato in ogni pozzetto. Il substrato è un solido a -20 ° C in modo da rendere aliquote e recuperare il numero richiesto di aliquote necessarie per il rilevamento fuori dal freezer ben prima del tempo in modo che sia completamente scongelato da questa fase.
  14. A 30 min fermare la reazione aggiungendo 50 ml di 3 M NaOH a ciascun pozzetto.
  15. Leggere l'assorbanza a 405 nm immediatamente il lettore di piastre ELISA.

Nota: Se la proteina ricombinante di interesse non si fissa alle pozzetti, è possibile modificare thcomposizione e / pH del tampone considerevolmente (tampone carbonato pH 10,0) o aggiungere caotropi (urea) per tentare di aiutare attaccamento proteina ai pozzetti della piastra di microtitolazione. Tuttavia, ristabilendo che la proteina ricombinante: 1) rimane legato ai pozzetti micropiastre alle condizioni per la selezione affinità e, 2) mantiene la sua attività biologica dopo la rimozione del pH elevato / caotropo è raccomandato.

2. Crescere Host batterica (BLT5403) per titolazione

  1. Autoclave (Figura 2A) dieci flaconi da 250 ml Erlenmeyer e 3 tubi di coltura. Fai LB liquido e LB agar per versare le piastre terreni solidi. Raffreddare LB agar a 50 ° C e aggiungere ampicillina a 100 mcg / ml prima asceptically versando in piastre di Petri in una cappa a flusso (Figura 2B).
  2. Anche in una cappa a flusso (Figura 2B) realizzato un LB, 100 pg / ml di ampicillina (LB AMP100) piastra di agar per singole colonie di BLT5403 a magazzino mantenuto nel 15% (v / v)glicerolo a -80 ° C (Figura 2C). Posizionare la piastra capovolta a 37 ° C per una notte in un incubatore per la crescita (Figura 2D).
  3. In mattinata, inoculare 50 ml di LB AMP100 in un pallone da 250 ml Erlenmeyer con una singola colonia scelto dalla piastra. Incubare a 37 ° C, 200 rpm in un agitatore orizzontale (figure 2E e 2F), e utilizzare uno spettrofotometro per monitorare densità delle cellule al OD 600 = 0,5 e 0,6 (Figura 2H).
  4. Versare le cellule in una provetta da 50 ml Falcon o simile, e mantenere a 4 ° C fino al momento dell'uso (figura 2G). Le cellule di solito rimanere vitali per ~ 1 settimana.
  5. Fai da 500 ml LB, metterlo in un pallone sconcertato Fernbach e autoclave esso. Una volta che è sterile, posizionare il pallone a 4 ° C (Figura 2G) o temperatura ambiente fino alla notte del "DAY ONE" qui sotto.

Nota: le cellule L'host battericheBLT5403, esprimendo una fonte plasmide-carico della T7 proteina del capside nativo senza che il T7 metà, e vettori low-copiatura non possono replicare correttamente, sono estremamente sensibili al virus. E 'indispensabile per evitare la contaminazione. La contaminazione finirà verificarsi in quel punto tutte le superfici a contatto con i virus / batteri infetti devono essere puliti con il 70% (v / v) di etanolo o fregati con detersivo (Figura 2I). Se questo è inefficace, è necessaria una decontaminazione completa di tutte le superfici che possono resistere Envirocide (Figura 2J). Inizia BLT5403 cellule da freezer magazzino ogni nuovo turno di selezione affinità per contribuire a mitigare la contaminazione del magazzino in 4 ° C, e garantire le cellule vigorose vengono utilizzati nel protocollo. Puntali delle pipette barriera Filter sono essenziali.

3. Selezione Affinity

DAY ONE

  1. Mark micropiastra con inchiostro indelebile, e designato che pozzi conterranno che protEins / modifiche. (A causa di problemi di contaminazione, piastre vengono mai riutilizzati). Eseguire questa in 3 repliche di pozzetti per ogni proteina e trattamento.
  2. Lavare la piastra a lungo con acqua e rimuovere l'acqua dal schioccando la piastra capovolta su 4 strati di carta assorbente tra i lavaggi. Immobilizzare, in 100 ml di Tris, pH 7,5, (o tampone di scelta) della proteina ricombinante (10 pg / ml) in sei pozzetti, o BSA (10 mg / ml) in tre pozzi, per un totale di 9 pozzi per primo round di selezione affinità. Coprire piatto con pellicola trasparente e lasciare per una notte a 4 ° C (Figura 2G).
  3. Assicurarsi che non ci sono 9 x 250 palloni ml (cfr. 2.1 sopra) puliti, autoclave, e etichettati in modo appropriato (codifica con nastro colorato funziona bene, Figura 2F).
  4. Calcolare il volume di lisato fagico da utilizzare per ciascun pozzetto in base al titolo della biblioteca utilizzato e il numero di fago da schermare.
  5. Assicurarsi che le cellule BLT5403 fresche sono pronti per l'usoper la titolazione questa selezione affinità turno domani (Figura 3A).
  6. Garantire 1x sufficiente TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris base, pH 7,6) e 1x TTBS (TBS 1x + 0,05% (v / v) Tween 20) sono disponibili per eseguire 10 x 200 lavaggi microlitri per il numero di pozzetti utilizzati . Inoltre, Preincubare il TTBS alla temperatura di selezione di affinità. Assicurarsi che un backup, sigillato, 50 ml tubo Falcon di 1x TTBS esiste alla temperatura di selezione affinità con sufficiente 1x TTBS.
  7. Preparare 3 trattamenti x 3 x 3 repliche triplicato di 1,5 ml provette Eppendorf (27 in totale) con 990 ml di LB 100 AMP ciascuno ed etichettare in modo appropriato (ad esempio 10 -2). Questi sono per i batteri infettati recuperati dai pozzi micropiastre domani. Segnare la diluizione su un lato del tubo (10 -2) e un numero crescente sull'altro lato ("1"). Per ogni tubo Eppendorf, etichettare anche un tubo borosilicato e uno LB 100 piastra AMP. In questo way, le piastre e provette borosilicato sono numerate 1, 2, 3, 4, 5, ecc. per rendere la titolazione andare più veloce. In seguito il numero semplice può essere abbinato alla diluizione e il trattamento sul tubo Eppendorf (ad esempio il tubo # 12 era il terzo triplice copia della prima replica del controllo BSA per diluizione 10 -5). Provette Eppendorf negozi e LB 100 lastre AMP notte a 4 ° C (Figure 2G e 3B).

Per esempio: Avviare etichettatura 1,5 ml provette Eppendorf per tre 10 -2 diluizioni del fago dalla replicazione BSA uno così come 1, 2 e 3 (tre letture triplicato di fago titolo per la replica di uno), e poi segnare provette borosilicato 1, 2 e 3, in cui i batteri infetti verranno mescolati con batteri infetti e top agarosio prima di versarlo sulla LB 100 lastre AMP agar (Figura 3C).

  1. Per il d serialeilutions, etichetta provette Eppendorf e, in ogni, aggiungere 900 ml di LB 100 AMP. Una volta che le diluizioni iniziali (10 -2) di batteri infettati sono fatti per ogni proteina / trattamento, la replica e triplice copia, domani, saranno ben mescolati e 100 microlitri prelevati da loro e aggiunto alla provetta Eppendorf appropriato contenente 900 microlitri LB 100 AMP per la diluizione 10 -3 (tubi 4, 5 e 6 per la replica di un controllo BSA). Questi saranno mescolati bene a loro volta e le 10 -3 diluizioni saranno utilizzati per effettuare le diluizioni 10 -4 (7, 8, 9). Utilizzare i 10 -4 diluizioni per i 10 -5 diluizioni (10, 11, 12), ecc. per ottenere il titolo per la prima delle tre repliche BSA (pozzetti).
  2. Lo stesso sarà fatto per la replica due BSA (ben 2), la replica BSA tre (ben 3), le tre repliche di esche avvelenate, e infine le tre repliche dei pozzi dell'esca. Alla fine, ci dovrebbe essere provette etichettate from 1-135 (135 è l'ultima triplice copia dell'ultima replica dell'esca alla diluizione massima di 10 -6). Conservare le provette Eppendorf notte a 4 ° C (Figura 3C mostra l'Eppendorf e tubi borosilicato per tutte le diluizioni dei triplicato delle tre repliche (tre pozzi) di BSA.
  3. Inizia 2 o 3 tubi di coltura di cellule BLT5403 (raccolte da singole colonie da un giorno all'altro piastra LB AMP100 appena striato, dal punto 2.2) che crescono nello shaker incubazione (Figure 2E e 2F) come cultura durante la notte. Per 500 ml LB (punto 2.5 sopra), aggiungere ampicillina a 100 pg / ml e riporre la beuta Fernbach nel morsetto nell'incubatrice agitando quindi sarà a 37 ° C e aerata la mattina seguente (Figura 2F).

Nota: Intorno a tre e quattro possono richiedere diluizioni approssimative di fino a 10 -10 volume di pHage al volume di LB AMP100.

SECONDO GIORNO

  1. Il mattino seguente, posizionare i autoclave, vuoti 9 x 250 ml Erlenmeyer palloni (uno per ogni micropiastra bene) nei morsetti nello shaker incubazione. Inoculare il 500 ml LB 100 AMP con 500 microlitri di una delle culture durante la notte di BLT5403 cellule hanno iniziato ieri sera (vedi precedente punto 3.8), richiudere e avviarlo in crescita (37 ° C, 220 rpm). Accendere lo spettrofotometro (Figura 2H) e impostare per leggere l'assorbanza a 600 nm.
  2. Rimuovere la micropiastra da 4 ° C, rimuovere la pellicola di plastica e rimuovere qualsiasi proteina non legata dalla piastra mediante lavaggio 10x con 200 ml ciascuna, di 1x TBS pH 7.5 e schioccando la piastra capovolta sul tovagliolo di carta tra i lavaggi. Blocco con 200 microlitri 5% (w / v) BSA o 200 microlitri 5% (w / v) reagente bloccante in TBS per 1 ora (o tutta la notte se conveniente) con la piastra avvolto nella pellicola.
  3. Lavare il blocco soluzione 10x con 200 ml ogni volta di 1x TBST, schiocco la piastra capovolta su 4 strati di carta assorbente tra i lavaggi. E 'possibile riempire i pozzetti con 200 microlitri di acqua, in questa fase, coprire con pellicola trasparente e metterli a 4 ° C per memorizzare per un massimo di 1 settimana.

Nota: Avviare la cultura abbastanza presto che, dal momento in cui il fago infetta-BLT5403 dal completamento della selezione affinità sono pronti ad aggiungere, le cellule in 500 ml sono compresi tra 0,6 e 1,0 OD 600. Se crescono molto oltre 1.0, lisi può non verificarsi a causa di limitazioni di risorse come cellule avvicinano fase stazionaria. Se le cellule non raggiungono un OD 600 di 0,6 almeno prima dell'introduzione del fago, la molteplicità di infezione può essere troppo alta, rapidamente uccidendo le cellule, che può influenzare la rappresentazione del lisato. Se le cellule non sono ancora avvicinando un OD 600 di 0,6 dal completamento della selezione di affinità, INOCUlate il pallone con più BLT5403 dal secondo (o anche da entrambi secondo e terzo) provette agitazione a 37 ° C (Figura 2F). Se un OD 600 di 1,0 si avvicina troppo velocemente, spegnere il riscaldatore e lo shaker e aprire il coperchio per raffreddare la cultura e morire di fame i batteri per l'ossigeno. Riprendere riscaldamento / scuotendo una volta che il fago sono stati aggiunti.

Da qui utilizzare puntali filtro per evitare fago contaminazione incrociata.

  1. Una volta che il pallone viene inoculato, mettere la libreria di fagi (100 ml) con le proteine, sigillare la piastra con pellicola trasparente e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  2. A 55 min, registrare la OD 600 delle cellule. Il tempo di raddoppio è di circa ogni 20 minuti. Agire di conseguenza (vedi "Nota" di cui sopra).
  3. Alla fine di un'ora rimuovere l'involucro di plastica dalla piastra e lavare immediatamente agitando il fago nei rifiuti trasformato e poi rapidamente aggiungendo 200 ml di TB 1xST. (Usare un multipipettor con una testa microlitri 1 = 100 e la pipetta impostato su 2 [ie eroga 200 ml / pistone depressione] per questo e va rapidamente). Impostare un timer per 1 min. Dopo 1 min, scuotere tampone in rifiuti trasformati, piastra schiaffo a testa in giù su carta assorbente e mettere di nuovo in panchina (piastra 25 ° C). Ripetere i passaggi di lavaggio 10x.
  4. Dopo il 10 ° lavaggio, prendere 200 ml di BLT5403 cellule dal tubo Falcon da 50 ml a 4 ° C e metterli nel fondo del pozzo da cui l'ultimo lavaggio di TTBS è stato rimosso. Avvolgere le piastre in pellicola trasparente e mettere a 37 ° C per 20 minuti per ottenere qualsiasi fago ancora bloccato per l'esca per infettare i batteri (vedere nota in discussione riguardante fago persistente recuperato e / o un elevato background da fago indiscriminatamente vincolante).
  5. Alla fine di 20 min, scartare le piastre e prendere 10 microlitri batteri dalla BSA a 25 ° C una replica bene e metterlo in 990 ml di LB 100 AMP contrassegnati"1". Ripetere altre due volte per tale bene (tubi 2 e 3) con conseguente 3 triplicato di 1/100 diluizioni del fago dal pozzo. Questa è una replica BSA campionata tre volte. Queste diluizioni saranno utilizzati per stimare il titolo media ± SEM per che la replica di BSA.
  6. Fare lo stesso per la replica 2 e 3 di BSA (tre campioni triplicato di 10 ml ciascuna), per i tre pozzi replicate della proteina esca avvelenata, e per la proteina esca. Impostare questi 27 tubi Eppendorf da parte ed ottenere i restanti 170 ml di batteri infetti nei pozzetti crescenti verso lisi.
  7. Se i batteri nel contenitore sia a OD 600 = 0.6-1.0, decantare 50 ml cellule dal Fernbach pallone in ciascuna delle nove 250 ml beute. Prendete i restanti 170 ml di fago-infetti BLT5403 batteri nel replica BSA 1 bene e aggiungere agli 50 ml cellule marcate "BSA Rep 1" (nastro giallo). Fate questo per tutti i nove pozzi e metterli agitazione in incubatrice ( Figura 2F).
  8. Monitorare le cellule nello shaker 37 ° C incubando di volta in volta per lisi (circa 3 ore dal momento dell'inoculazione). Effettuare le diluizioni dei 27 diluizioni iniziali (10 -2) nelle appropriate, provette Eppendorf etichettati in questo periodo.
  9. Per eseguire queste diluizioni dagli iniziali 27 diluizioni da 3.12 sopra, prendere 100 ml di LB con i batteri dalla provetta Eppendorf 1 (BSA replica uno, prima dei campioni in triplicato di questa 1/100 di diluizione da questo bene) e aggiungerlo al 900 ml di LB in tubo Eppendorf 4 (1 x 10 -4 diluizione di replica BSA uno, primo dei campioni in triplicato di questa ben).
  10. Eliminare la punta barriera filtro per uno nuovo prima di ottenere 100 ml di LB con i batteri da Eppendorf tubo 4 per aggiungere ai 900 ml di LB a tubo Eppendorf il 7 (1 x 10 -5 diluizione di BSA una replica, prima del triplice copia campioni di questa pozzetto). Continuare le diluizioni (dproprio a 1 x 10 -6) per tutti triplicato di tutte le repliche di tutte le proteine ​​e trattamenti (135 tubi in totale).
  11. Una volta che le cellule hanno lisato, portare la cultura a 0,5 M NaCl con l'aggiunta di 5 ml di una M di NaCl magazzino 5 e trasferire in una bottiglia centrifuga etichetta.
  12. Centrifugare a 8000 xg per 10 min a 4 ° C. Decantare il surnatante (virus) in una sterile 50 ml provetta Falcon pulito.
  13. Aggiungere alcune gocce di cloroformio al supernatante decantato in provetta Falcon.
  14. Conservare a 4 ° C per la prossima tornata di selezione affinità.

4. Terzo giorno

  1. Autoclave o candeggina tutto da laboratorio che è stato utilizzato per generare questa selezione affinità giro per prepararsi per il prossimo giro.

5. Titolazione

  1. Numero altrettanti solidi LB 100 lastre di AMP in quanto vi sono diluizioni in ordine crescente (ci dovrebbe essere ora 1 piastra per ogni tubo borosilicato e il tubo Eppendorf, ciascuno con lo stesso numero). Put i piatti nel 37 ° C incubatore (Figura 3D).
  2. Sciogliere top agarosio (1,0 g Bacto Triptone, 0,5 g estratto di lievito, 0,5 g NaCl, 0,6 g di agarosio, fare a 100 ml, autoclave), allentando il tappo della bottiglia di agarosio superiore e alternativamente forno a microonde la bottiglia e vorticoso a mescolare fino a quando la parte superiore agarosio si è completamente sciolto. Mettere la bottiglia nel bagnomaria raffreddare a 50 ° C (Figura 3E).
  3. Prendere una pipetta borosilicato da 10 ml con una pompa pipetta divisoria. Accendere un becco Bunsen. Girare un supporto di polistirolo tubo Falcon o coperchio di raffreddamento a testa in giù sulla panca e posizionare le piastre LB100 AMP da 1 a 6 (fresco di incubatore 37 ° C) su di esso, Plate 1 alto (Figura 4A). Il polistirolo mantiene i piatti caldi.
  4. Mettete 250 ml BLT5403 celle da 4 ° C in ciascuna delle provette numerate borosilicato preparati sul giorno precedente (punto 3.7 e le figure 4B e 4C). Arvariare i tubi borosilicato numerati della stessa serie ascendente come le diluizioni dei 1,5 ml provette Eppendorf (Figura 4A).
  5. Mettere 100 microlitri della diluizione in provetta Eppendorf 1 in 250 microlitri di cellule in borosilicato provetta 1 (Figure 4D e 4E). Scaldare il primo 5 in della pipetta sulla fiamma un po '(non troppo! ~ 3 colpi, Figura 4F) e immergersi nella top agarosio fuso. Pull up 3 ml e fornire rapidamente nella provetta in cima alla cellule / fago (Figura 4G).
  6. Mescolare muovendo con un dito tenendo il tubo con l'altra mano (Figura 4H) e versare il contenuto sul piatto (Figura 4I). Inclinare la piastra e usare la provetta per inseguire le bolle e macchie secche fino a quando l'intera piastra è coperto dal agarosio superiore. Metterlo da parte, eretta sulla panca a raffreddare.
  7. Eliminare il tubo borosilicato, espellere la punta barriera del filtro, ottenere ununa fresca e continuare finché non sono stati placcati tutte le diluizioni. Recupera LB 100 piatti AMP dal termostato in quanto sono esaurite, ma non più di 6 alla volta o si raffreddano e l'agarosio top solidifica troppo in fretta.
  8. Una volta che l'agarosio superiore è solido, girare le piastre a testa in giù (è importante per fare questo). Altrimenti, l'agar / agarosio "piange", si condensa sul coperchio, scende verso il basso sul agarosio superiore e corre su di esso, prendendo il fago con esso rendendo impossibile titolo precisione) e: 1) mettere le piastre nei 37 ° C incubatore [be back 4 ore più tardi a contare il titolo come T7 è aggressivo] OR: 2) Lasciare a testa in giù sulla panca e sono pronti la mattina successiva per contare titolo.
  9. Prendere tutte le precauzioni necessarie per proteggere contro la frantumazione del vetro, o lesioni se non, mettere il tappo della bottiglia di agarosio top indietro liberamente e forno a microonde l'agarosio alto fino ad ebollizione. Fate questo due volte. Lasciate raffreddare, stringere laberretto e metterlo via. Girare il bagno d'acqua fino alla sua solita temperatura o spegnerlo. Mettere le diluizioni in frigorifero a 4 ° C. Essi saranno necessari per interpretare i titoli e / o ripetere alcuni dei titolazione.

6. Determinazione e Calcolo Titer

  1. Esaminare la placca formata sui piatti e scartare quelli con confluenti lisi (figura 5A ad esempio 10 -2 diluizione). Determinare quale delle diluizioni seriali restanti hanno prodotto sufficientemente pochi placca per consentire un conteggio accurato (Figure 5A 5B un nd). Registrare il numero di targa di queste lastre (Tabella 1, Figura 5B).
  2. Moltiplicare il numero di targa dalla diluizione e quindi moltiplicare questo numero per 100 per ottenere il numero di unità formanti placca per ml di batteri infettati presi dai pozzetti (ovvero solo 10 ml di batteri infettati sono stati presi per ciascuna delle triplicati e so ciò deve essere moltiplicato per 100 per ottenere conteggi per ml). Media il numero di placca Unità Formanti (PFU) per millilitro, (PFU / ml di batteri infetti non diluiti prelevati dalla micropiastra bene), nei tre triplicato tratti da questo bene.
  3. Formare un Gran medio dei conteggi per i tre pozzi replicati e calcolare l'errore standard della media (Tabella 1). Questo è ciò che verrà registrato nella figura dell'aumento del fago titolo per ogni fase di selezione affinità e trattamento (Figura 5C).

7. Isolamento Targa, PCR e sequenziamento

  1. Alla fine di affinità tornata di selezione 4, selezionare 18 individuale, ben definito, colonie placca e, utilizzando una pipetta Pasteur sterile, stuzzicadenti, giallo puntale o un dispositivo simile, nucleo di questi placca dalle piastre di titolazione. Se si utilizzano tubi o suggerimenti, prima bagnare l'interno con il Tris-HCl, pH 8,5 nel tubo Eppendorf (Figura 5D).
  2. Se si utilizza tubi, assicurarsi che il tubo borosilicato non detiene gocce in eccesso di Tris, deprimere la lampadina e, con essa ancora compressa, spingere la punta della pipetta borosilicato attraverso una targa ben isolata diritto alla piastra di Petri di plastica sotto (Figura 5E). Rilasciare la lampadina con la punta della pipetta ancora in agar / agarosio superiore e aspirare il nucleo (Figura 5F, vedi freccia).
  3. Espellere il nucleo in 100 ml di Tris-HCl, pH 8,5 nel tubo appropriato (Figura 5G) e vortex brevemente.
  4. Riscaldare a 20 microlitri di questa volume a 65 ° C per 10 min.
  5. Centrifugare il volume riscaldato a 13.000 xg in una centrifuga da banco a temperatura ambiente per 10 min. Prendere 3 microlitri dal surnatante di tale aliquota per essere utilizzato nelle reazioni PCR con T7-UP e T7-GIU primer.
  6. Per ciascuno dei 18 isolato placca, soluzioni riscaldate, fanno un 50 microlitri reazione di PCR utilizzando una temperatura di annealing di 58 ° C e 35 cicli.
  7. Eseguire 20 ml di eacreazione h su un 1% (w / v) gel di agarosio contenente 0,015% (v / v) di etidio bromuro. Visualizzare con un transilluminatore con adeguata protezione per gli occhi e guanti da laboratorio nitrile. (ATTENZIONE: il bromuro di etidio è un potente mutageno.) Fotografare il gel e smaltire i materiali contaminati correttamente (Figure 6A e 6B).
  8. Se gli ampliconi sono prodotti singoli, e non dal vettore vuoto (prodotto scorre vicino 100 bp su un 1% (w / v) TAE gel di agarosio; Figure 6A e 6B frecce), pulire le restanti 30 microlitri per uso come un modello sequenziamento. Se non un singolo prodotto sul gel (Figura 6B, placca 15), tagliato la banda più prominente (s) dal gel ed estrarre il DNA dal gel usando un kit.
  9. Sequenza gli ampliconi che non sono vettori vuoti utilizzando il primer T7-UP.
  10. Esaminare ogni sequenza per le braccia linker e, da queste informazioni, determinare la posizione di inizio dell'inserto. Utilizzare il Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, National Library of Medicine) per determinare l'identità del cDNA codificato, se l'inserto è in cornice e, in caso affermativo, quale porzione della proteina sequenza codificante (CDS) è stata mostrata e catturato dalla esca.

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Risultati

Potendo compromettere la capacità del esca per interagire con le proteine ​​fagiche-visualizzata (metabolicamente avvelenare l'esca) fornisce un controllo negativo potente per questa tecnica. E 'inoltre consigliabile determinare se l'esca, quando si lega al micropiastra bene, mantiene la sua funzione. Entrambi questi controlli aumenterà la fiducia che interagiscono, proteine ​​fago-visualizzato recuperati dal esca nonpoisoned sono legittime.

Campionamento tre triplicato da ciascu...

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Discussione

Eseguendo l'esperimento in tre pozzi replicate, fago acquisito indipendentemente vincolante all'esca stessa proteina può essere distinto anche se sono lo stesso clone (cioè nessuna differenza nella sequenza nucleotidica della regione CDS che è stata acquisita ma questi sono stati recuperati dai pozzi indipendenti). Altrimenti, l'unico modo per distinguere tra fago codifica vincolante per l'esca stessa proteina è se sono indipendentemente invertire regioni trascritte che differiscono in qualche p...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo progetto è stato parzialmente finanziato da un NSF IOS (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA di Grant Seed (2.011-04.375), e Sir Frederick McMaster Research Fellowship a ABD.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
TryptoneBecton Dickinson Co.
Estratto di lievitoBecton Dickinson212750
AgarBecton Dickinson214010
Cloruro di sodioFisher ScientificBP358-10
AgarosioResearch Products InternationalA20090
Reagente bloccanteEMD Chemicals Inc.69064
Tween 20 FisherScientificBP337-100
Idrossido di sodioFisher ScientificBP359-212
Sodio dodecil solfatoFisher ScientificBP166-500
Tris BaseFisher ScientificBP152-5
CloroformioFisher ScientificBP1145-1
Escherichia coli BLT5403EMD Chemicals Inc.BLT5403Genotipo: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillina, Sodium SaltResearch Products InternationalA40040
Bromuro di etidioFisher ScientificBP102-1
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-Aldrich Corp.A-9647
Penta-HIS anticorpo primarioQiagen Inc.34660
Capra coniugato di fosfatise alcalina anti-topoSigma-Aldrich Corp.A-5153
para-NitrofenilfosfatoSigma-Aldrich Corp.N-7653
T7-UP primerEMD Chemicals Inc.5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
primerEMD Chemicals Inc.5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Kit
purificazione PCR QiaquickInc.28104
Qiaquick Kit di estrazione del gel Qiagen Inc.28706
Kit di sequenziamento del ciclo Big Dye Terminator v3.1Invitrogen Life Technologies4336917
Blocco riscaldantePierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)18780
Piastre per colture cellulari a 96 pozzettiCorningCostar 3590
Isotemp Incubator Oven FisherScientific516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ inFisher Scientific13-678-20A
ChromaView TransilluminatorUVP Inc.TS-15
UV ShieldOberon071AF
Guanti, NitrileFisher Scientific19-170-010C
Provette sterili da 1,5 mlUSA Scientific Inc1615-5500
Pipette in borosilicato da 10 mlFisher Scientific13-678-25E
Provette per coltura in borosilicatoFisher Scientific14-961-27
Uniskan I, lettore di piastre ELISALabsystem e Flow Laboratories, Helsinki, FinlandiaTipo 362
211705 di

Riferimenti

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